Terapia genica, Notas de estudo de Engenharia de Produção

Baixe Terapia genica e outras Notas de estudo em PDF para Engenharia de Produção, somente na Docsity! ã : Universidade Nova de Lisboa = Faculdade de Ciências e Tecnologia Monografia Novas Tecnologias Terapêuticas A Terapia Génica Aplicações de Engenharia Genética à Biotecnologia Alexandra Isabel Cardoso Nunes nº12221 Ana Marisa da Fonseca Salgueiro n.º 12014 Sofia Santos Costa n.º12104 Vera Mónica Gonçalves n.º11172 ANO LECTIVO 2003/2004 N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 2 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS 5 ÍNDICE DE TABELAS 6 ABREVIATURAS UTILIZADAS 7 1. PREÂMBULO 8 2. INTRODUÇÃO 9 Novas Tecnologias Terapêuticas 9 Terapia Génica 9 Abordagem histórica da terapia génica 9 1ª Metade do Século XX 9 2ª Metade do Século XX 10 Século XXI 10 Abordagem germinativa e somática 11 2.1.1. Terapia Génica Somática 11 2.1.2. Terapia Génica Germinal 11 2.1.3. Comparação entre TGS e TGG 11 Terapia Génica Humana vs. Terapia Génica Animal 11 3. ABORDAGENS EM TERAPIA GÉNICA 13 Tipos de Células-Alvo 13 3.1.1. Transferência Génica 13 3.1.1.1. ex vivo 13 3.1.1.2. in vivo 14 Métodos de Transferência Génica 14 3.1.2. Métodos Químicos 15 3.1.3. Métodos Biológicos 16 3.1.4. Métodos Físicos 18 Abordagem Clássica em Terapia Génica 18 3.1.5. Aumento do número de cópias de um gene 19 3.1.6. Morte assistida de células específicas 19 Abordagem não-clássica em Terapia Génica 19 3.1.7. Correcção assistida de mutações 19 3.1.7.1. Correcção a nível do DNA 19 Quimeroplastia 20 N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 5 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 3-1 - MÉTODO DE INTRODUÇÃO DE GENES MODIFICADOS ATRAVÉS DE PROCESSOS IN VIVO E EX VIVO 14 FIGURA 3-2 – DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE PROTOCOLOS EM FUNÇÃO DE CADA VECTOR UTILIZADO, 15 FIGURA 3-3 – TRANSFERÊNCIA DE GENES UTILIZANDO UM RECEPTOR DE ENDOCITOSE. 15 FIGURA 3-4 – MECANISMO DA REPARAÇÃO DE RNA POR MEIO DE RIBOZIMAS TRANS- ACTUANTES 21 FIGURA 4-1 – DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE PROTOCOLOS EM FUNÇÃO DA DOENÇA A TRATAR 26 FIGURA 5-1 – MORFOLOGIA DE UM OLHO COM GLAUCOMA E PADRÃO APRESENTADO PELO NERVO ÓPTICO NUMA SITUAÇÃO NORMAL E NUMA SITUAÇÃO GLAUCOMATOSA 29 FIGURA 5-2 – ESQUEMA REPRESENTATIVO DA PARTE FRONTAL DO OLHO 29 FIGURA 5-3 – IMAGEM ILUSTRATIVA DA PERDA DA VISÃO PERIFÉRICA – VISÃO TUBULAR 30 FIGURA 5-4 – MORFOLOGIA TÍPICA DENDRÍTICA DAS CÉLULAS RETINAIS GANGLIARES VISUALIZADA COM PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE 32 FIGURA 5-5 – ESQUEMA DO OLHO DE RATO. 34 FIGURA 5-6 – FOTOGRAFIA DE UM CÉREBRO DE UM PACIENTE AFECTADO PELA DOENÇA DE HUNTINGTON E DE UM CÉREBRO DE UM INDIVÍDUO NORMAL, 35 FIGURA 5-7 – DEGRADAÇÃO DE RNA PELO MECANISMO DE RNA DE INTERFERÊNCIA. SOMENTE OS QUADRADOS AZUIS POSSUEM ACTIVIDADE NUCLEOLÍTICA 38 FIGURA 5-8 – ESTRUTURA DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA HUMANA 40 FIGURA 5-9 – ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) 40 FIGURA 5-10 – CICLO DE REPLICAÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) 41 FIGURA 5-11 – REGIÕES DO CÉREBRO ONDE SE LOCALIZAM OS PRINCIPAIS TIPOS DE TUMORES 44 FIGURA 5-12 - TERAPIA GÉNICA IN VIVO PARA O TRATAMENTO DE TUMORES CEREBRAIS 47 FIGURA 5-14 - MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE UMA CULTURA DE LINFÓCITOS INFILTRANTES DE TUMOR 48 N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 6 ÍNDICE DE TABELAS TABELA 3-1 – COMPARAÇÃO ENTRE VÁRIOS MÉTODOS QUÍMICOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA. 16 TABELA 3-2 – COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS BIOLÓGICOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA17 TABELA 3-3 – COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA 18 TABELA 3-4 – VANTAGENS, DESVANTAGENS E APLICAÇÕES CORRENTES DAS VÁRIAS ABORDAGENS NÃO-CLÁSSICAS APLICADAS EM TG 23 TABELA 5-1 – SINTOMATOLOGIA E CONDIÇÕES ESPECIAIS PARA O DESENVOLVIMENTO DO GLAUCOMA 30 TABELA 5-2 – EXEMPLOS DE GENES-ALVO E TECIDOS QUE PODEM SER UTILIZADOS NO TRATAMENTO DO GLAUCOMA 32 TABELA 5-3 – TECIDOS/CÉLULAS RELEVANTES NO TRATAMENTO DO GLAUCOMA POR TGO E VECTORES UTILIZADOS 33 TABELA 5-4 – ASPECTOS PRINCIPAIS NA TG APLICADA AO TRATAMENTO DO GLAUCOMA UTILIZANDO UM AAV MODIFICADO COM INSERÇÃO DO BDNF 34 N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 7 ABREVIATURAS UTILIZADAS TG – Terapia génica TGG – Terapia Génica Germinal TGS – Terapia Génica Somática TR – Transcritase Reversa LTR – Long Termination Repeat dsDNA – double-strand DNA wt – wild-type ssDNA – single-strand DNA ITR – Inverted Termination Repeat rAAV –Vírus recombinante associado ao adenovírus IRS – Inverted Repeat Sequence E1 Ori – Origem de replicação em E. coli OriS – Origem de replicação em HSV RV – Retrovírus LV – Lentivírus AV – Adenovírus AAV Vírus associado ao adenovírus mtDNA – DNA mitocondrial OFHT – Oligonucleótidos formadores de hélices triplas PANs – peptídeos de ácidos nucleicos ODNs – Oligodeoxinucleótidos RNP – Ribonucleoproteínas ADA – Adenosina Deaminase PIO – Pressão Interna Ocular CRG – Células gliares da retina RT – Rede Trabecular TGO – Terapia Génica Ocular BDNF - brain-derived neurotrophic factor EC - Epitélio ciliar MC - Músculo ciliar WPRE - Elemento regulatório pós- transcricional da hepatite de marmota GFP – Proteína Verde Fluorescente Htt – Huntingtina BHK - baby hamster kidney cells CNTF - ciliar neurotrophic factor RNAi – RNA de interferência siRNA – short-interfering RNA SNP – Single-Nucleotide Polymorphism CAH – Cromossoma Artificial Humano PGL – Progressive Generalized Limphadenopathy PTN – Proteínas transdominantes negativas SNC – Sistema Nervoso Central GBM – Glioblastoma multiforme BHE - Barreira Hemato-Encefálica CPVs - Células produtoras de vectores retrovirais HSV –Vírus Herpes Simplex TC – Timidina cinase GCV – Ganciclovir CD – Citosina desaminase FC - 5-Fluorocitosina CPA – Ciclofosfamida FNTα - Factor α de necrose tumoral FCEV - Factor de crescimento endotelial vascular LITs - Linfócitos infiltrantes tumorais IDSC – Imunodeficiência Severa Combinada DOTC - Deficiência da ornitina transcarboxilase N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 10 A experiência de Avery, McLeod e McCarty, em 1944, contribuiu em muito para o surgimento da Genética Humana: é conhecida, em bactérias, a possibilidade de transferir informação genética de um organismo para outro – fundamento da terapia génica. Pensou- se então, pela primeira vez, em transformar genes com o intuito de curar doenças humanas. Foram, assim, desenvolvidas linhas de células geneticamente modificadas e criadas técnicas de DNA recombinante. 2ª MET A DE DO SÉC ULO XX Em 1959, Muller, no seu livro “The Guidance of Human Evolution”, expressou as suas dúvidas sobre a viabilidade de realizar alterações directas ou substituições em genes, gerando um importante estímulo para um debate sobre a ética da intervenção genética [3]. Em 1962, no simpósio Man and His Future, coordenado pela Fundação CIBA/NOVARTIS, começou a ser definida a ideia de que uma intervenção a nível molecular na linha germinativa seria muito mais difícil que a modificação das células somáticas. Na década de 80, o grupo World Council of Churches defendeu que a terapia génica somática para a cura de doenças é eticamente aceitável, enquanto que a intervenção na linha germinativa para a prevenção, cura de doenças ou promoção das capacidades humanas é inaceitável - posição ortodoxa sobre a TG. Os anos 80/90 destacaram-se pelas intensas discussões éticas sobre a cura de doenças utilizando a linha somática e a germinal. Para facilitar o diálogo entre as várias instituições então criadas, foi fundado, em 1990, o jornal “Human Gene Therapy”, nos Estados Unidos da América (EUA), assim como a publicação britânica “Gene Therapy”. Ainda durante a década de 90, o National Institute of Health (NIH), juntamente com a FDA, aprovou o primeiro protocolo para teste de terapia génica em humanos: transferência de genes do sistema imunitário para um paciente em estado avançado de neoplasia maligna. No entanto, o objectivo deste estudo não era avaliar a eficiência terapêutica, mas sim demonstrar que a transferência génica é segura [4]. Nos EUA, Michael Blaese e W. French Anderson propuseram um protocolo para o tratamento de 2 crianças com deficiência da enzima adenosina deaminase (ADA) – imunodeficiência severa combinada (IDSC). Este foi o primeiro caso de sucesso da TG. N o a n o d e 1 9 9 9 , a TG sofreu um grande contratempo aquando da morte do jovem Jesse Gelsinger [2]. Este adolescente de 18 anos participava num estudo de terapia génica somática na Universidade da Pensilvânia, onde recebeu tratamento para corrigir um distúrbio metabólico de origem genética, denominado deficiência da ornitina transcarboxilase (DOTC), que tem como principal consequência a retenção de amónia no organismo. Uma resposta do seu sistema imunitário aos elevados níveis de vectores adenovíricos, que transportavam o gene para a produção da referida enzima, causou a sua morte. Foi, então, o primeiro paciente a morrer num ensaio clínico de terapia génica. Todavia, mais de 400 ensaios envolvendo mais de 4000 pacientes, já haviam sido conduzidos sem qualquer registo de morte. SÉC UL O XXI O desenvolvimento da terapia génica sofre outro contratempo, em Janeiro de 2003, quando é registado o segundo caso de leucemia em crianças tratadas com vectores retrovíricos. O tratamento incidia sobre a IDSC, também conhecida como "síndrome do menino da bolha". Após o primeiro diagnóstico de leucemia, o FDA suspendeu 3 testes similares nos EUA. N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 11 Como precaução, a interrupção foi estendida às demais experiências até o caso ser esclarecido [2]. ABORDAGEM GERMINATIVA E SOMÁTICA A Terapia Génica pode ser dividida em dois ramos, somático e germinal, dependendo do tipo de células ou tecidos-alvo a que se destina. Não obstante, no presente trabalho focar- nos-emos somente na TG somática. 2.1.1. TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA A TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA (TGS) foca-se no corpo (soma), tentando corrigir um fenótipo doente mediante o tratamento de algumas células somáticas do indivíduo afectado. De facto, nem todas as células do tecido doente necessitam de se tornar transgénicas; em alguns casos, uma percentagem de células transgénicas é suficiente para melhorar a totalidade dos sintomas da doença [5]. 2.1.2. TERAPIA GÉNICA GERMINAL A TERAPIA GÉNICA GERMINAL (TGG) tem como alvos tecidos ou células germinais. Desta forma, se um gene for transferido com sucesso para a célula-alvo, é provável que seja transferido a todas as células somáticas do indivíduo. Logo, do ponto de vista técnico, é mais fácil que a Terapia Génica Somática, uma vez que pode ter como alvo uma única célula ou um agregado de células não-diferenciadas. 2.1.3. COMPARAÇÃO ENTRE TGS E TGG A terapia génica somática possui menores riscos para os pacientes que a terapia génica germinal, uma vez que a expressão inadequada dos genes incorporados afecta somente os alvos (células ou tecidos específicos). Além disso, muitas vezes é possível reverter os efeitos da terapia génica somática, através de cirurgia ou tratamento com radioterapia e/ou quimioterapia. Já a terapia génica germinal possui um efeito sistémico e irreversível, pelo que qualquer erro pode afectar o desenvolvimento, a diferenciação celular, o crescimento e muitos aspectos do comportamento e fisiologia do paciente. Além disso, a terapia génica germinal possui maiores riscos para as gerações futuras que a terapia génica somática. Por outro lado, sendo também projectada para influenciar as futuras gerações, permite que os defeitos genéticos induzidos artificialmente possam ser propagados a mais indivíduos sob a forma de uma nova mutação patogénica hereditária. TERAPIA GÉNICA HUMANA VS. TERAPIA GÉNICA ANIMAL A terapia génica, enquanto método de tratamento, pode ser aplicada não só em humanos, como também em animais. No entanto, a sua aplicação em animais não tem só fins terapêuticos. Um bom exemplo, é a sua aplicação em porcos [7]. Vários cientistas do “Baylor College of Medicine”, em Houston, introduziram uma hormona de crescimento em porcos, via TG. Os resultados mostraram que estes cresceram cerca de 40% mais que os animais não tratados. Sendo assim, visto os porcos serem saudáveis e apresentarem menos necessidades alimentares, este tratamento apresenta muitos benefícios na suinicultura. N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 12 No presente trabalho, vamos apenas ter em conta a TG aplicada ao tratamento de doenças humanas, independentemente dos benefícios que os animais possam vir a ter. N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 15 Figura 3-2 – Distribuição do número de protocolos em função de cada vector utilizado, in http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical. 3.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS Os métodos químicos de entrega genética operam fundamentalmente em três níveis: condensação e complexação de DNA, endocitose e sinalização/entrada no núcleo. As moléculas de DNA interagem electrostaticamente com reagentes catiónicos, sendo posteriormente incorporadas pelas células através de mecanismos de endocitose. Figura 3-3 – Transferência de genes utilizando um receptor de endocitose. Adaptado de Strachan and Read [6]. Dos métodos químicos mais usados in vitro, salienta-se a precipitação do DNA com Ca3(PO4)2 (fosfato de cálcio) e o uso de polielectrólitos, como o dextrano-DEAE. N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A 16 Relativamente ao uso in vivo, são de referir os lipossomas, os quais podem ser divididos em dois grandes grupos: virossomas, se possuírem proteínas virais ou peptídeos fusogénicos, ou imunolipossomas, caso possuam moléculas de sinalização incorporadas. Tabela 3-1 – Comparação entre vários métodos químicos de transferência génica. Método Aspectos gerais Vantagens Desvantagens Endocitose mediada por receptor - Complexo DNA/molécula para receptor de superfície celular - Transfecção eficiente - Não há integração Lipossomas - Vesículas esféricas bilipídicas sintéticas - Empacotamento in vitro e usado in vivo - Fácil preparação - Comporta grandes fragmentos - Elevado grau de pureza - Não-imunogénicos - Não há integração - Baixa eficiência de transfecção DNA-Ca3(PO4)2 - Precipitado formado por mistura de soluções de PO43-, CaCl2 e DNA - Simples e barato - Vasto leque celular - Expressão transiente ou estável - Morte celular mínima. - Baixa eficiência de transfecção e expressão - Só ex vivo DNA-DEAE Dextrano - Complexo catião polimérico/DNA. - Vasto leque celular-alvo - Mais reprodutível que DNA-Ca3(PO4)2 - Tóxico - Só ex vivo - Baixa eficiência de transfecção - Expressão transiente Cromossoma Artificial Humano (CAH) - Gene(s) terapêutico(s) e elementos regulatórios - Maior capacidade de inserção - Não-tóxicos - Não-imunogénicos - Não necessitam de integração - Em desenvolvimento 3.1.3. MÉTODOS BIOLÓGICOS Um dos métodos biológicos mais usados são os vírus, os quais constituem um sistema natural de transferência de genes. A sua base de utilização, enquanto vectores, reside no facto de apresentarem um tropismo natural para determinados tecidos, introduzindo a sua informação genética e tornando-se parte integrante da célula hospedeira. Ao encontrar-se formas de inactivar ou remover genes virais e substituí-los com o material genético terapêutico de interesse, torna-se possível tirar vantagem da elevada eficiência da transferência génica. N O VAS TE C N O L O G I A S TE R AP Ê U T I C AS – A TE R AP I A G É N I C A 17 Tabela 3-2 – Comparação entre os métodos biológicos de transferência génica. Método Características Produção Vantagens Desvantagens Retrovírus (RV) - RNA TR - Sequências LTR - Tropismo para células do sangue e do tubo gastrointestinal - Uso de células empacotadoras, sequências LTR, promotores e sinal de empacotamento - Sistema muito bem estudado in vivo e ex vivo - Elevada taxa de transdução - Integração e propagação estável - Comportam até 9 kb - Baixos títulos - Baixa taxa de entrega in vivo - Imunogénico - Células mitóticas - Mutagénese Adenovírus (AV) - dsDNA - Tropismo células epiteliais sistema respiratório e tracto gastrointestinal - Uso de células empacotadoras: Clonagem directa e Recombinação homóloga - Comportam até 36 kb - Elevados títulos - Transdução eficiente células mitóticas e pós-mitóticas - Epissoma - Imunogénico - Baixo grau de selectividade - Expressão transiente - Depuração do epissoma - Reversão para wild-type (wt) Vírus associados ao Adenovírus (AAV) - Parvovírus - ssDNA - Sequências ITR - Infecção latente - Dependente de vírus auxiliar - rAAV - Plasmídeos com ITRs e gene exógeno - Empacotados mediante uma co-infecção - Amplo espectro de hospedeiros - Usado células mitóticas e pós- mitóticas - Integração dirigida (AAVS1 cromossoma 19) - Não-patogénicos - Comportam até 4,5 kb - Baixo título Vírus Herpes simplex (HSV) - dsDNA linear - Sequências IRL e IRS - Neurotrófico - Ciclo lítico ou lisogénico - E1 Ori e OriS, sequências de emcapotamento e promotores Co-infecção - Epissomal - Infecção latente - Comportam mais de 20 kb - Elevado título - Imunogénicos - Baixa eficiência de transdução - Expressão transiente - Em desenvolvimento Lentivírus (LV) - Retrovírus complexos - Infectam macrófagos e linfócitos - Alteração proteínas de envelope - Tranfecção em células mitóticas - Tropismo para grande variedade de células - Integração inespecífica - Reversão para wt - Comportam até 9 kb N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 20 QUIME RO PL AST IA A quimeroplastia baseia-se na ligação de uma molécula quimérica de DNA/RNA3 à região genómica que contém a mutação. Essa ligação é feita por complementaridade entre ambas, à excepção do local da mutação, onde é originada uma perturbação estrutural, que activa mecanismos de reparação de DNA endógenos. OL IG ONUC LE ÓT IDOS F ORMAD ORE S DE HÉ LICE T RIP L A (OFHT) Os OFHT ligam-se de forma específica a regiões genómicas polipurina/polipirimidina, comuns em genomas de mamíferos, por ligações de hidrogénio de Hoogsteen4. Essa propriedade pode ser explorada de modo a que seja possível a mutagénese dirigida do genoma, corrigindo defeitos genéticos. RE PA RA ÇÃ O P OR OL IGONU CL EÓT IDOS O uso de pequenos oligonucleótidos na reparação génica baseia-se em fenómenos de recombinação homóloga. Os oligonucleótidos são constituídos por DNA em cadeia simples ou dupla, sendo em grande parte homólogos a sequências-alvo de DNA genómico ou epissomal, de modo a catalisar mecanismos intracelulares enzimáticos que medeiam a recombinação homóloga. 3.1.7.2. COR RE CÇÃ O G ENÉ T IC A A N ÍVEL DO RNA R IBO ZIMAS Ribozimas são pequenas moléculas de RNA com propriedades catalíticas e que apresentam dois componentes essenciais: uma sequência de reconhecimento do alvo, necessária para emparelhar por complementariedade com as moléculas de RNA-alvo e, uma componente catalítica, que cliva a molécula de RNA-alvo em dois produtos de RNA não-funcionais, sendo posteriormente degradados pela célula. De entre as várias classes de ribozimas as mais referidas são as ribozimas hammerhead e as ribozimas hairpin, as quais são trans-actuantes. A reacção de trans-excisão é semelhante à reacção de auto-excisão, propriedade presente nos intrões do grupo I. 3 É uma molécula em cadeia simples, composta por nucleótidos de DNA e RNA, com 70 a 80 bases, que adopta uma conformação em “harpa”. 4 A ligação de Hoogsteen, refere-se a um padrão invulgar de emparelhamento, em que um par de bases se forma recorrendo a pontes de hidrogénio com o N7dos resíduos de adenina e guanina [8]. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 21 Figura 3-4 – Mecanismo da reparação de RNA por meio de ribozimas trans-actuantes [9]. 3.1.8. INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO GÉNICA 3.1.8.1. AO NÍVEL D O DNA – ESTR AT ÉG IA S ANT IGEN E OL IG ONUC LE ÓT IDOS F ORMAD ORE S DE HÉ LICE T RIP L A Os OFHT podem ser também utilizados como um método de inibição da expressão de um determinado gene mutante. Um oligonucleótido poderá ser complementar a regiões de um gene, inibindo a sua expressão. PEP TÍDE OS D E ÁC ID OS NUCL EIC OS (PANS) Os PANs são moléculas mímicas neutras de ácidos nucleicos. A cadeia açúcar-fosfato dos ácidos nucleicos naturais é substituído por um esqueleto peptídico sintético, geralmente formado por unidades N-(2-amino-etil)-glicina. Os PANs são desenhados de modo a reconhecer e emparelhar com sequências complementares num dado gene, formando hélices triplas estáveis e, consequentemente, interferindo com a transcrição desse gene. A inibição da transcrição é conseguida devido a impedimentos estruturais, quer por bloqueio ou restrição da acção da RNA polimerase. 3.1.8.2. AO NÍVEL D O RNA – EST RA TÉ GIAS AN TISEN SE ÁC ID OS NUCL E IC OS ANT ISENSE Ácidos nucleicos antisense são polímeros sintéticos ou naturais que emparelham com mRNAs alvo, inibindo a sua função. Existem várias classes de ácidos nucleicos antisense, N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 22 entre as quais, oligodeoxinucleótidos (ODNs)5 modificados quimicamente, PANs e ribozimas. A inibição da expressão de um transcrito mutante pode ser efectuada pela indução da degradação do mRNA recorrendo, por exemplo, à enzima RNase H (cliva RNA num híbrido RNA/DNA). Outros mecanismos antisense baseiam-se no bloqueio de sequências do mRNA para ligação aos ribossomas; na inibição da formação de complexos RNP- proteína; ou no sequestro de híbridos oligonucleótido-mRNA alvo no núcleo, impedindo a translocação do mRNA para o citoplasma. 3.1.8.3. AO NÍVEL D A PROT EÍNA AN TICO RP OS INT RAC EL UL AR ES Os anticorpos possuem funções extracelulares, sendo excretados para o meio exterior ou transportados para a superfície de células B, de modo a funcionar como receptores de antigénio. Porém, avanços recentes permitiram desenhar genes codificantes de anticorpos intracelulares. Estes são modificados de modo a possuírem uma cadeia única por emparelhamento dos domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve através de uma ponte peptídica. Os anticorpos intracelulares podem ser direccionados para um dado compartimento celular onde poderão ligar-se a uma molécula celular específica, por exemplo uma proteína que origine uma patologia, inactivando-a. AP T ÂMER OS Aptâmeros, são oligonucleótidos modificados em cadeia simples, que reconhecem sequências específicas de uma determinada proteína. Apesar da sua composição semelhante aos ácidos nucleicos naturais, possuem açúcares modificados no carbono 2, o que aumenta a sua resistência a nucleases. O mecanismo de inibição dos aptâmeros é fundamentalmente diferente do dos oligonucleótidos antisense, uma vez que a inibição proteica advém da ligação específica aptâmero-proteína numa determinada conformação tridimensional. A elevada especificidade desta interacção faz com que os aptâmeros sejam, em geral, altamente direccionados para os seus alvos, mesmo entre isoformas de uma enzima [10]. PROT EÍNA S MUT ANT ES Em muitos casos, os polipéptidos wt associam-se naturalmente formando multímeros. A introdução de genes codificantes de proteínas mutantes com capacidade de ligação específica aos polipéptidos wt, torna possível a inibição da função dos mesmos, por interferência na formação dos agregados proteicos. 3.1.9. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES ABORDAGENS DA TG NÃO-CLÁSSICA A comparação entre as diferentes abordagens utilizadas na terapia génica não-clássica encontra-se sumariada na tabela da página seguinte. 5 Oligorribonucleótidos com um grupo hidroxilo na posição 2’ do açúcar. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 25 3.1.10. LIMITAÇÕES TECNOLÓGICAS 3.1.10.1. CUR TO T EMPO DE VIDA Para que a TG possa ser eficiente, o DNA terapêutico tem de ser introduzido de forma estável e funcional, quer seja integrado no genoma quer sob a forma de epissoma. Ao integrar-se no genoma, o gene perpetua-se ao longo das várias gerações, expressando-se a longo-prazo. Por outro lado, ao permanecer em epissoma, a expressão do gene poderá diminuir com o tempo, fazendo com que o efeito terapêutico seja de curta-duração. Neste caso, os pacientes terão de ser submetidos a ciclos múltiplos de terapia para atingir resultados satisfatórios. 3.1.10.2. PR OBL E MA S CO M VE CT OR ES VIRA IS Os vírus apresentam uma variedade de potenciais problemas para o paciente: não controlo da expressão génica, toxicidade, respostas imunológicas e inflamatórias. Além disso, existe a possibilidade destes, uma vez introduzidos nas células do paciente, poderem não estar inactivos ou mesmo recuperar a sua capacidade de causar infecção. Outros problemas que advêm da utilização de vectores virais são a incapacidade de controlar a integração do transgene e a activação ocasional de fragmentos génicos latentes de outros vírus. 3.1.10.3. INTE GR AÇ ÃO GÉN IC A A integração dos genes no cromossoma do hospedeiro é, sem dúvida, um factor decisivo para alcançar uma expressão génica permanente. No entanto, visto a inserção ocorrer, por vezes, de forma aleatória, a expressão génica resultante pode ser baixa ou até mesmo nula. Note-se que a integração de um gene numa zona crucial pode causar morte celular, como por exemplo a inactivação de um gene supressor de tumores. 3.1.11. DOENÇAS MULTIGÉNICAS Os melhores casos para a aplicação da TG são aqueles em que ocorrem alterações num só gene. Contudo, alguns dos distúrbios mais frequentes, tais como doenças cardiovasculares, pressão arterial elevada, doença de Alzheimer, artrite e diabetes, são causadas por efeitos combinados de variações em muitos genes e por condições ambientais. Deste modo, com o conhecimento actual, a TG revela-se pouco eficaz para o tratamento deste tipo de doenças. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 26 4. TIPOS DE DOENÇAS TRATADAS EM TERAPIA GÉNICA A partir do momento em que a primeira experiência de terapia génica mostrou resultados positivos, a investigação nesta área aumentou exponencialmente. Actualmente, encontram- se em desenvolvimento uma série de estudos de forma a criar protocolos, com aplicação clínica, para um maior número de doenças. Verifica-se que a maioria de protocolos existentes incide sobre o tratamento de cancro (ver figura 4-1). Figura 4-1 – Distribuição do número de protocolos em função da doença a tratar, in http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/ . DOENÇAS GENÉTICAS Entende-se por doenças genéticas distúrbios a nível do material genético. Este tipo de alterações pode ter origem em factores intrínsecos, tais como mutações originadas durante o crossing-over, sendo, portanto, passadas à descendência. Para além da casualidade genética, verifica-se que os factores ambientais também podem originar mutações, atingindo apenas células somáticas. É, ainda, de notar que as várias anomalias, resultantes da alteração do genótipo, podem expressar-se fenotipicamente de forma constante ou serem somente detectadas em determinadas condições.
Doenças Monogénicas (Single-gene ou Mendelianas) - Têm origem em mutações que ocorrem na sequência de DNA de um só gene. Exemplos deste tipo de doença são: • Fibrose Cística • Anemia Falciforme • Deficiência no gene ADA • Doença de Huntington6 6 Doença descrita no capítulo 5 desta monografia. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 27
Doenças Multigénicas - Resultam de mutações em vários genes e/ou em em diferentes cromossomas. Exemplos deste tipo de doença são: • Doença de Alzheimer • Algumas formas de Diabetes • Cancro • Obesidade
Doenças Cromossómicas – Resulta de anormalidades ao nível da estrutura dos cromossomas. Exemplos deste tipo de doença são: • Síndrome de Down • Síndrome de Klinefelter • Síndrome de Turner
Doenças Mitocondriais – Resultam de mutações a nível do DNA mitocondrial. São doenças caracterizadas por deficiências a nível do metabolismo energético e por um padrão de herança materna. Exemplos deste tipo de doença são: • Doença de Parkinson • Doença de Alzheimer SISTEMA IMUNITÁRIO As imunodeficiências resultam da ausência ou falha da função normal dos elementos do sistema imunitário, devido a mutações nos genes das células envolvidas na resposta imunitária, tais como as imunoglobulinas, células B e células T. Exemplos deste tipo de doença são:

      – Distúrbio em que a perda de função enzimática conduz a uma acumulação de produtos tóxicos para as células do sistema imunitário, destruindo-as e, deste modo, debilitando-o.
Doenças autoimunes – Resposta excessiva do sistema imunitário e consequente ataque a células e moléculas do próprio organismo. • Síndrome de DiGeorge • Imunodeficiência Severa Combinada • Asma • Algumas formas de Diabetes • Imunodeficiência com hiper-IgM N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 30 Figura 5-3 – Imagem ilustrativa da perda da visão periférica – visão tubular [17]. O glaucoma resulta de diferentes doenças que afectam o olho, estando estas não só associadas a um aumento da PIO, como também ligadas a factores de desenvolvimento e/ou progressão dos danos glaucomatosos (por exemplo, doenças cardiovasculares, autorregulação vascular defectiva, apneia do sono, doenças autoimunes, etc). Estes últimos estão a tornar-se numa área de investigação de interesse crescente, principalmente no Japão e nos EUA onde representam, respectivamente, 70% e 80% dos factores causadores de glaucoma [11]. Os sintomas da doença, assim como os principais factores para o seu desenvolvimento, são descritos, sinteticamente, na tabela seguinte. Tabela 5-1 – Sintomatologia e condições especiais para o desenvolvimento do glaucoma [14, 17]. SINTOMAS CONDIÇÕES PARA O DESENVOLVIMENTO - Trocar com frequência a graduação dos óculos - Dificuldade em adaptar à obscuridade; - Perda de visão lateral - Visão embaciada - Visão de halos coloridos ao redor das luzes - Cefaleia ou dor ocular, etc. - Pessoas acima dos 45 anos - Pessoas com histórico clínico familiar - Pessoas com PIO anormalmente elevada - Pessoas com ascendência africana ou asiática - Pessoas com diabetes, miopia, uso prolongado de esteróides (corticóides) e lesão ocular prévia T IPOS DE GLAUCOMA De um modo geral, existem 4 tipos de glaucoma [14]:  Glaucoma de ângulo aberto: a PIO aumenta lentamente; a córnea adapta-se às alterações sem sofrer muitos danos; não é acompanhado de sintomatologia.  Glaucoma de ângulo fechado: pode manifestar-se através de picos intermitentes da PIO (embaciamento visual, halos coloridos, etc.) ou como uma crise de glaucoma agudo. Este último é caracterizado pela elevação abrupta da PIO (dor ocular, cefaleia, vómitos, vermelhidão).  Glaucoma congénito: má formação no sistema de drenagem que ocorre do humor aquoso. Manifesta-se em recém nascidos e crianças; podendo ocorrer num olho ou em ambos.  Glaucoma secundário: neste tipo de glaucoma, o aumento da pressão intra-ocular ocorre após doenças inflamatórias, catarata avançada, alteração dos pigmentos naturalmente existentes dentro dos olhos, entre outros. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 31 5.1.2. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS Actualmente, o tratamento do glaucoma passa por uma tentativa em abrandar a perda de visão, mantendo a PIO em níveis aceitáveis e controlados. Esse tratamento pode ser realizado usando 3 tipos de terapia [17]: 1. Tratamento Clínico: o tratamento mais comum consiste em colírio, embora ocasionalmente não seja suficiente. 2. Tratamento por Laser: consiste em cirurgia por laser na RT, na tentativa de torná-la funcional; é um método popular como passo intermédio entre os fármacos e a cirurgia tradicional. 3. Tratamento cirúrgico: implica a criação de um novo sistema de drenagem para o olho, através de uma incisão. A mais comum das cirurgias é chamada de trabeculoplastia. Um efeito secundário (em mais de um terço dos pacientes) é o desenvolvimento de cataratas num prazo de 5 anos. Os tratamentos actuais para esta disfunção não levam à cura. Para além dos efeitos secundários, apenas um diagnóstico precoce e eficaz da doença ajuda a prevenir a perda de visão total. 5.1.3. TERAPIA GÉNICA PARA O GLAUCOMA Uma vez que o glaucoma resulta de diferentes doenças, oferece uma variedade de alvos para uma nova forma de tratamento – a terapia génica ocular (TGO). Desde o aparecimento da TG que a sua aplicação às doenças oculares tem sido investigada, uma vez que o olho é um alvo atractivo devido à sua elevada acessibilidade [18]. No entanto, isso não significa que a TGO seja já um sucesso clínico [16]. 5.1.3.1. TE CIDOS AL VO E SIST EMA S DE TR ANSF ER ÊN CIA GÉN IC A Apesar da base genética da maior parte dos glaucomas não estar ainda bem definida, a transferência e a expressão de genes cujos produtos são factores neuroprotectores e/ou factores que contribuem para a diminuição da PIO, podem servir para modificar a fisiologia de células relevantes e bloquear a patogénese [11]. De entre as alterações patológicas causadas no nervo óptico está a privação de factores neurotróficos9, por exemplo BDNF (brain-derived neurotrophic factor), e a libertação de agentes neurotóxicos para a retina, tais como glutamato, óxido nítrico e radicais livres. Os potenciais alvos da TGO (ver tabela 5-2) incluem vários tecidos/células oculares, estando divididos em dois grupos: o segmento anterior, constituído pela RT, o epitélio ciliar (EC) e o músculo ciliar (MC); e o segmento posterior, do qual fazem parte as CRGs e as células de Müller. 9 Grupo de proteínas que regulam o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 32 Figura 5-4 – Morfologia típica dendrítica das células retinais gangliares visualizada com Proteína verde fluorescente. Escala da barra: 50µm. Adaptado de Martin et al [12]. Tabela 5-2 – Exemplos de genes-alvo e tecidos que podem ser utilizados no tratamento do glaucoma [12]. Tecido/Célula- Alvo Gene-Alvo Efeito Previsto RT Proteínas reguladoras do citoesqueleto Estímulo do escoamento do humor aquoso por disrupção do citoesqueleto celular EC Receptores
-Adrenérgicos Melhoramento da resposta das células do EC a substâncias que inibem a produção do humor aquoso. Células do MC Gene Desconhecido Regulação da síntese de prostaglandina. CRGs Factor Neurotrófico (BDNF) Efeito neuroprotector através da super-expressão do BDNF transgénico. Células Müller GLAST Regulação do transportador endógeno de glutamato para melhorar os seus níveis extracelulares. Até à data, foram testados 6 sistemas de transporte de genes terapêuticos para as células/tecidos de interesse [12], os quais se encontram sumariados na tabela 5-3. As diferenças encontradas entre os vectores estão relacionadas com o tropismo tecidular, capacidade do vector, respostas imunológicas, toxicidades, entre outras. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 35 A TG para o tratamento do glaucoma é um método que se tornará muito eficiente na prevenção da cegueira causada por esta doença. No entanto, é ainda necessário um aperfeiçoamento em vários aspectos [11], nomeadamente:
papel da matriz extracelular e da sinalização celular na RT do olho;
regulação e produção do humor aquoso, assim como de factores libertados pelo EC que poderão modelar a RT;
conhecimento dos caminhos de activação da morte das CRGs;
modelos animais que traduzam melhor as alterações que ocorrem em todos os tecidos do olho humano;
identificação de genes adicionais envolvidos no desenvolvimento do glaucoma. DOENÇA DE HUNTINGTON 5.1.4. CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA A doença de Huntington (DH) é um distúrbio autossomático dominante neurodegenerativo hereditário, que afecta aproximadamente 1 em cada 10 000 indivíduos caucasianos. Indivíduos não-caucasianos apresentam uma frequência mais baixa [19]. Este distúrbio foi descrito pela primeira vez pelo médico George Huntington, em 1872. É uma doença caracterizada por uma disfunção progressiva motora, psicológica e cognitiva, devida a uma perda gradual de massa neuronal. A neuropatologia é extremamente restricta, ocorrendo a atrofia no striatum e, em menor extensão, no córtex cerebral. A idade média de manifestação da doença é de 40 anos, sendo, aproximadamente, 15 anos o intervalo normal entre o diagnóstico e a morte de um paciente. Todavia, existem casos em que a doença se manifesta de um modo precoce ou tardio, dos 2 anos aos 90 anos, respectivamente. Ou seja, a doença exibe uma penetrância dependente da idade [19]. Figura 5-6 – Fotografia,à esquerda, de um cérebro de um paciente afectado pela doença de Huntington, à direita, cérebro de um indivíduo normal, in http://pathology.mc.duke.edu/neuropath/CNSlecture4/CNSlecture4.htm . BA SE GEN ÉT ICA DA DO ENÇ A D E HUNT INGT ON A DH tem origem numa mutação no gene IT15 situado no cromossoma 4. Este gene é constituído por 67 exões e codifica uma proteína com 3 144 aminoácidos, a huntingtina N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 36 (Htt), cuja função é ainda desconhecida, mas que demonstra ser essencial para o desenvolvimento neuronal normal. O exão 1 contém uma repetição trinucleotídica CAG que codifica para o aminoácido glutamato, seguida por outra repetição codificante para o aminoácido prolina. A mutação no gene IT15 que origina a DH altera o número de unidades da repetição trinucleotídica CAG. Esta repetição é polimórfica, compreendendo 10 a 35 unidades em alelos ditos normais. Nos alelos mutantes, a repetição é expandida para um número de unidades que varia de 36 a mais de 150. Contudo, a maioria dos alelos mutados contém 40 a 50 unidades CAG. Esta expansão tem como consequência o alongamento da região poliglutâmica na Htt. Embora não seja conhecido o efeito específico deste alongamento, indícios apontam para que a mutação que o origina, aja como uma mutação de “ganho-de- função”, isto é, conferindo à proteína novas propriedades sem, no entanto, eliminar a sua função normal. Esta propriedade parece ser incrementada com o aumento do número de unidades CAG, pois o número de unidades consecutivas é o principal determinante da severidade da doença. Alelos com 40 a 50 unidades estão associados a uma manifestação da doença numa fase adulta da vida. Quanto maior for o número de unidades presentes no alelo mutado, mais cedo esta se manifestará. Estudos em ratos transgénicos indicam que a expansão das regiões ricas em aminoácidos glutamato originam a formação de agregados da proteína mutante Htt. Com o avançar do tempo, esses agregados proteicos atingem uma massa crítica, migrando para o núcleo dos neurónios, formando inclusões intranucleares. Esta migração torna as células neuronais mais vulneráveis a agentes químicos produzidos endogenamente, provocando a sua morte [20]. 5.1.5. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS Até aos dias de hoje, os tratamentos existentes para a DH baseiam-se no alívio sintomático. Alguns medicamentos têm sido utilizados, de modo eficiente, no alívio dos sintomas e no controlo da doença. Contudo, não detêm o seu progresso. Inúmeros fármacos, como antidepressivos e neurolépticos, têm sido utilizados no tratamento de depressões e psicoses, respectivamente. Porém, a sua utilização origina graves efeitos secundários, como o desenvolvimento de discinesia tardia10 e parkinsonismo. Fármacos como a coenzima Q10 e a nicotinamida têm suscitado interesse, pois apresentam efeitos neuroprotectores [21,22]. Procedimentos neurocirúrgicos aplicados desde há vinte anos no tratamento da doença de Parkinson, começaram a ser utilizados na DH. Novas abordagens cirúrgicas têm também sido desenvolvidas, tais como o transplante de células neuronais em troca de células afectadas em locais específicos do cérebro de pacientes com DH, e implantes de cápsulas no cérebro que secretam um fármaco directamente no local danificado [22,23]. 5.1.6. NOVAS ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO: TERAPIA GÉNICA TER AP IA GÉNIC A NEUR OP RO TE CT OR A Dos 636 ensaios clínicos de TG a decorrer, apenas um se centra na DH. Este baseia-se numa TG neuroprotectora em que células BHK (baby hamster kidney cells) geneticamente 10 Diminuição ou extinção de movimentos voluntários. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 37 modificadas encapsuladas, segregam o factor neurotrófico ciliar humano CNTF [Bachoud- Levi et al (2000)]. Vários factores neurotróficos possuem a capacidade de proteger neurónios do striatum em vários modelos experimentais da DH. O ensaio clínico centra-se numa abordagem ex vivo onde são implantadas, no ventrículo lateral direito de 6 pacientes, células BHK. Estas encontram-se rodeadas por uma membrana semi-permeável, sendo usadas para secretar continuamente e a longo-prazo CNTF. Os sintomas associados à DH podem ser monitorizados com testes neurofisiológicos, neurológicos, motores e neuropsicológicos. O ensaio encontra-se em fase I, ou seja, está actualmente a ser avaliada a segurança e tolerância que os pacientes apresentam ao tratamento realizado. TER AP IA GÉN IC A BA SEA DA EM RNA D E INT ERF ER ÊN CIA A TG baseada em mecanismos de RNA de interferência (RNAi) tem como objectivo diminuir os efeitos citotóxicos que a proteína mutante Htt origina nas células neuronais. O RNAi representa uma defesa celular natural de controlo da expressão de genes exógenos presente na maioria dos eucariotas, incluindo os humanos. Mecanismo de interferência O processo inicia-se com moléculas de dsRNA com extremidades 3’ em cadeia simples. Estas moléculas são reconhecidas pela enzima Dicer (presente em D. melanogaster, e semelhante à RNase III), sendo clivadas em moléculas de dsRNA com 21-23 nucleótidos, denominadas short interfering RNA (siRNA). Estes siRNAs são incorporados num complexo contendo ribonucleoproteínas (siRNP), formando posteriormente o complexo RISC com actividade endonuclease. O silenciamento de um dado transcrito é induzido por dois mecanismos: i) clivagem de mRNAs nos quais há uma sequência inteiramente complementar ao siRNA e ii) inibição da transcrição de mRNAs que são, quase na totalidade, complementares ao siRNA, por bloqueio da acção ribossomal. O silenciamento pode ser também efectuado a nível do DNA, sendo a inibição da expressão génica induzida pela metilação de DNA homólogo num promotor. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 40 Figura 5-8 – Estrutura do Vírus da Imunodeficiência Humana Humana in http://hiv.buffalo.edu/html/hiv_pharm.html. Figura 5-9 – Organização do genoma do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Genes estruturais: gag (proteínas da Cápside); pol (enzimas virais); env (glicoproteínas especificas do receptor CD4). Genes regulatórios. Genes codificantes de proteínas de maturação. Adaptado de: Human Immunodeficienct Virus (HIV), http://www.els.net . O HIV apresenta determinadas particularidades que o tornam de difícil combate. Uma delas reside na capacidade da transcriptase reversa poder utilizar várias moléculas de RNA em simultâneo, da qual resulta uma elevada frequência de recombinação. Para além disso, é possível a síntese de DNA utilizando moléculas de RNA danificadas. Verifica-se, igualmente, que a ocorrência de erros durante a síntese do DNA é elevada (cerca de 3×10-5 erros/base em cada ciclo de replicação), o que constitui um factor muito importante para a diversidade genética [27]. O ciclo de replicação de qualquer retrovírus divide-se em nove etapas. 5´LTR gag pol vif vpr env vpu nef 3´LTR rev tat N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 41 Figura 5-10 – Ciclo de replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV). 1 – Ligação ao receptor celular; 2 – Fusão com a membrana celular; 3 – Libertação do material vírico; 4 – Síntese de DNA, por acção da Transcriptase reversa; 5 – Integração do genoma do hospedeiro; 6 – Replicação do genoma vírico; 7 – Síntese proteica; 8 – Maturação das proteínas víricas; 9 – Montagem e gemulação, In http://hiv.buffalo.edu/html/hiv_pharm.html . Relativamente à primeira etapa do ciclo de replicação, a entrada no hospedeiro, verifica-se que o HIV se revela mais eficiente que outros retrovírus, uma vez que possui uma enorme variedade de proteínas do envelope. Esta característica permite, também, que o HIV não seja reconhecido pelo sistema imunitário. O mecanismo de integração do genoma viral no cromossoma do hospedeiro ocorre de tal forma que é possível a produção de novos vírus com sequências celulares. Tal facto, permite que estes se expressem como oncogenes, para além de se incorporarem no genoma da linha germinal. 5.1.8. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS Os actuais métodos de combate à doença apontam para o uso de vacinas e fármacos. No entanto, estes promovem apenas a atenuação dos efeitos secundários e não a cura N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 42 definitiva. Assim sendo, a maioria dos esforços destina-se ao desenvolvimento de estratégias de TG para a inibição do HIV. 5.1.9. ESTRATÉGIAS PARA A TERAPIA GÉNICA ANTI-HIV A TG para as doenças infecciosas encontra-se direccionada no sentido de bloquear a expressão génica e/ou inibir a função proteica, impedindo a replicação do agente infeccioso. Os meios utilizados para atingir tal objectivo, dividem-se em três categorias: i. TG baseada nos ácidos nucleicos, incluindo DNA e RNA antisense, aptâmeros de RNA e ribozimas; ii. Uso de proteínas transdominantes negativas (PTNs) ou anticorpos intracelulares; iii. Imunoterapia através de vacinas génicas ou linfócitos específicos para cada agente patogénico. Neste capítulo serão apresentados exemplos das duas primeiras abordagens. 5.1.9.1. TER AP IA GÉNIC A BA SEAD A N OS ÁCIDO S NU CL EICO S RNA ANT ISE NSE O princípio base do funcionamento do RNA antisense é o bloqueio de regiões-chave do genoma viral. Vários estudos têm demostrado que as regiões com maior actividade anti- viral são as dos genes gag, tat e rev [Rittner and Sczakiel (1991);VandenDriessche et al (1994)]. Como resultado, consegue-se inibir a síntese destas proteínas (proteínas da nucleocápside, Tat e Rev, respectivamente) ao nível da transcrição. Neste tipo de procedimento, verifica-se que o efeito anti-viral está dependente da intensidade da transcrição do gene antisense, a qual deve ser muito superior aos níveis de expressão do HIV. Assim sendo, o uso de um vector retroviral contendo um promotor forte, como por exemplo o da polIII, precedido do gene antisense de interesse (ambos flanqueados por sequências LTRs), permite aumentar os níveis de expressão do gene terapêutico [Sullenger et al (1991)]. R IBO ZIMAS A acção catalítica do RNA sobre determinadas regiões do genoma viral afecta o ciclo replicativo do HIV, na medida em que são destruídos vários genes. A ribozima do tipo hammerhead encontra-se direccionada para a sequência viral gag [Sarver et al (1990)], reduzindo a quantidade de moléculas completas. Por outro lado, as ribozimas do tipo hairpin inibem eficientemente a replicação do vírus, para além de impedir a integração do RNA viral [Ojwang et al (1992)]. Verificou-se, também, ser possível estabelecer, in vitro, uma protecção permanente da infecção do HIV em células T humanas [Leavitt et al (1994)]. As unidades transcripcionais das ribozimas são bastante pequenas, permitindo não só a incorporação de várias dentro de um só vector, como também a utilização de diferentes tipo de ribozimas. A produção de ribozimas multidireccionadas, torna possível o corte em vários locais com sequências altamente conservadas [Chen et al (1992)]. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 45 sua curta duração de sintomas, a qual é muitas vezes menor que 6 meses [30]. Este tipo de tumor apresenta como sintomas: dores de cabeça (manifestação inicial comum), devido ao volume ocupado pelo tumor no interior do crânio e, consequentemente, ao aumento da pressão intracranial; inchaço do nervo óptico (cegueira); vómitos; alterações do estado mental; e fraqueza corporal. 5.1.11. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS Os tratamentos tradicionais para qualquer tumor cerebral consistem na remoção cirúrgica de toda ou parte da massa tumoral, radioterapia, quimioterapia e utilização de fármacos capazes de atravessar a Barreira Hemato-Encefálica (BHE). Esta, não estando presente em outros órgãos do corpo, é um sistema de defesa natural do cérebro, que restringe e controla a passagem de substâncias do sangue para o fluído extracelular cerebral, protegendo-o de compostos que possam alterar a sua função. No entanto, apesar dos avanços destas técnicas nas últimas décadas, os tumores cerebrais e, em particular, os GBM, continuam a possuir um prognóstico sombrio devido a diversos factores [31]. Algumas destas dificuldades prendem-se com problemas operacionais da neurocirurgia, em particular a localização anatómica do tumor (possível inacessibilidade) e a capacidade de uma célula tumoral invadir tecidos cerebrais periféricos, levando ao aparecimento periódico de tumores nas vizinhanças da secção removida. Além disso, durante a migração, estas células tumorais saem temporariamente do ciclo celular, tornando-se resistentes a terapias que têm como alvo células em divisão. Mesmo no interior do tumor, a maioria das células não está em divisão durante um dado tratamento. Outras complicações advêm de danos cerebrais causados pelos procedimentos terapêuticos, a heterogeneidade genética das células tumorais e a impermeabilidade relativa da BHE. Deste modo, apesar de serem bastante agressivas, as terapias correntes não representam propriamente uma cura, somente uma forma de controlar o rápido crescimento tumoral. 5.1.12. NOVAS ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO: TERAPIA GÉNICA Apesar da cura ou regressão de gliomas malignos ser pouco provável num futuro próximo, este tipo de tumores cerebrais tem sido alvo de TG com o intuito de aumentar a longevidade dos doentes. Deste modo, a TG ambiciona não só aumentar as terapias cancerígenas tradicionais (ver ponto 5.4.2.), como também permitir a acção de novos tipos de tratamento com maior especificidade. Assim sendo, os transgenes terapêuticos podem ser utilizados, por exemplo, para: i. Gerar compostos anti-cancerígenos no interior do tumor – activação pró-droga - , permitindo o aumento da sua concentração intratumoral sem aumentar a sua toxicidade sistémica; ii. Proteger tecidos normais periféricos ao tumor dos efeitos causados pela quimio e radioterapias; iii. Permitir a entrega contínua de proteínas de fusão secretadas, que combinam um ligando-alvo com uma toxina/enzima; iv. Permitir a expressão de proteínas supressoras de tumor ou apoptóticas, de forma a bloquear o crescimento ou causar a morte das células cancerígenas; v. Inibir a angiogénese; N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 46 vi. Estimular as respostas imunitárias contra antigénios tumorais; vii. Bloquear a invasão das células tumorais a tecidos normais periféricos. Note-se que estas potenciais estratégias terapêuticas podem ser aplicadas no tratamento de outros tipos de cancro, não sendo exclusivas dos tumores cerebrais. No entanto, neste trabalho, pretende-se somente abordar alguns destes procedimentos, elucidando, na generalidade, os seus princípios básicos. Apesar de ser uma limitação prática geral da TG, a dificuldade encontrada na introdução de transgénicos terapêuticos adquire, no caso dos tumores cerebrais, um maior grau de importância. De facto, mesmo em tumores induzidos experimentalmente, é difícil conseguir uma entrega maior que 5% na massa tumoral [31]. Deste modo, é essencial que as células transdutadas sejam capazes de exercer um efeito terapêutico nas células vizinhas não transdutadas – efeito bystander. Estão a ser explorados novos métodos com o objectivo de conseguir aumentar a eficiência da entrega de transgenes nas células tumorais, Até à data, todos os ensaios clínicos da TG para tumores cerebrais se basearam em estudos de fase I, focando-se na avaliação da toxicidade do tratamento realizado. Ao contrário dos promissores modelos pré-clínicos em roedores, nenhum destes ensaios mostrou uma eficácia notável, apontando para a elevada sensibilidade do cérebro, com consequências de febre, confusão, hemorragia e paralesia [31]. 5.1.12.1. ACT IVA ÇÃ O D E PR Ó-DRO GAS Tal como referido em 3.3.1., esta estratégia clássica consiste na produção intratumoral de um fármaco anti-cancerígeno por conversão in situ de uma pró-droga administrada às células tumorais. Este tipo de TG in vivo baseia-se na implantação, por injecção em múltiplas áreas da massa tumoral em crescimento (figura 5-12 (A)), de células produtoras de vectores retrovirais (CPVs), contendo genes activadores. Esta estratégia terapêutica tem como vantagem o alvo ser células em proliferação (por exemplo, células tumorais). Note-se que as células cerebrais normais encontram-se totalmente diferenciadas, pelo que não são afectadas. Esta abordagem pode ainda ser utilizada para melhorar a acção da radioterapia, aumentando a sensibilidade dos tumores à radiação. Esta, por sua vez, pode ser usada para induzir a expressão de transgenes via promotores activados por radiação. Um dos sistemas de activação de pró-droga mais usado, consiste na transferência de um gene do HSV de tipo-1 (codificante de uma timidina cinase (TC) [31]. O HSV-TC confere sensibilidade à pró-droga ganciclovir (GCV), posteriormente administrada, através da sua fosforilação intracelular (figura 5-12 (B) e (C)). Este composto trifosfatado, forma activa da pró-droga, pode ser incorporado no DNA em replicação, inibindo a DNA polimerase e causando a morte celular por terminação prematura da cadeia de DNA. O derivado fosforilado tem a capacidade de se difundir pelas junções gap e levar à morte as células tumorais vizinhas. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 47 Figura 5-12 - Terapia génica in vivo para o tratamento de tumores cerebrais, adaptado de Strachan and Read [6]. Outros sistemas activadores de pró-drogas bem caracterizados, são a citosina desaminase de Escherichia coli/5-fluorocitosina (CD/5-FC) e o citocromo P450 2B1/ciclofosfamida (CPA) [31]. 5.1.12.2. SUP RESSO RE S DE T UMO R E A POP T OSE O desenvolvimento de tumores malignos está intimamente relacionado com alterações nos genes envolvidos na regulação do ciclo celular - genes supressores de tumor e oncogenes [32]. Entre os vários genes supressores de tumor que conseguem desencadear a apoptose, o gene p53 tem sido o normalmente usado na terapia de tumores cerebrais. O objectivo é restaurar a função da TP53 e, consequentemente, inibir o crescimento tumoral, aumentando as acções de morte celular dos tratamentos tradicionais. Têm ainda sido feitos estudos [32] para inactivar os mecanismos de resistência à apoptose encontrados em algumas células gliomais, através da expressão de mutações dominantes negativas de Ras ou ribozimas contra a sua mensagem, para além da entrega de caspases e do factor α de necrose tumoral (FNTα). 5.1.12.3. ANGIOG ÉNE SE Tal como qualquer tipo de cancro, os tumores cerebrais necessitam da angiogénese para o seu crescimento exacerbado. Um número de factores que medeiam esta neovascularização, incluem angiopoetinas e o factor-1 inducível por hipoxia (que regula o factor de crescimento endotelial vascular (FCEV)) [31]. Os níveis de FCEV correlacionam-se com a progressão do tumor, sendo os níveis mais elevados encontrados nas formas mais malignas. A TG tem procurado estratégias para bloquear a angiogénese consistem na expressão de agentes anti-angiogénicos, como por exemplo: uma versão negativa dominante do receptor N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 50 6. PERSPECTIVAS FUTURAS A morte do jovem Jesse Gelsinger (ver ponto 2.3) fez com que a imagem da TG, na opinião pública, ficasse danificada. Porém, a investigação continua a progredir, estando os investigadores confiantes de que, no espaço de uma década, a transferência génica seja elevada do seu estatuto experimental actual para uma modalidade terapêutica. Para que essa transposição seja viável, vários problemas têm que ser ultrapassados, quer a nível tecnológico quer a nível de um maior entendimento sobre o genoma humano. Um dos maiores desafios da TG é conseguir incorporar o gene desejado no local apropriado nas células apropriadas, minimizando quaisquer reacções adversas. Muita da investigação tem sido concentrada no desenvolvimento do melhor vector para uma dada aplicação específica. Os sistemas de vectores actualmente utilizados apresentam uma baixa eficácia, fazendo com que os benefícios terapêuticos não sejam significativos. Contudo, têm sido feitos avanços na promoção da estabilidade vectorial, na redução de imunogeneicidade vectorial, na regulação da expressão génica, no desenvolvimento de estratégias de sucesso para direccionamento de vectores, novos sistemas de vectores lentivirais e estratégias de administração sistemática de partículas vectoriais imunogénicas [1]. Novas inovações poderão advir de sistemas híbridos com capacidade para incorporar componentes virais modificados para uma ligação específica e direccionada, a saber: genes imunossupressivos de várias viroses, mecanismos que permitirão a integração localizada específica (sequências de adenovírus associados, integrases retrovirais modificadas), utilização de sequências regulatórias da própria célula-alvo para um controlo fisiológico da expressão dos genes incorporados e cromossomas humanos artificiais (CAH) que comportam grupos inteiros de genes com os seus elementos regulatórios naturais. A integração de novas abordagens da TG na prática clínica necessita da garantia de recursos adequados, visto ser uma metodologia altamente especializada e cara, necessitando de centros médicos especializados e bem equipados. Requer, igualmente, uma uniformização dos padrões de trabalho. O alinhamento dos métodos de produção, purificação e armazenamento dos produtos obtidos com a indústria em relação à viabilidade económica do processo, é também um passo importante no futuro da TG. NECESSIDADE DA TERAPIA GÉNICA GERMINAL Embora nos dias de hoje a TGG não seja aplicável, devido tanto a questões éticas como a limitações práticas, o seu desenvolvimento será incontornável nos tempos vindouros. O facto desta abordagem ser feita a nível de células germinais garante que uma determinada modificação genómica seja herdada pelas gerações futuras, razão pela qual a sua utilização como meio de tratamento ou de alívio de doenças genéticas hereditárias é apelativa. Todavia, convém realçar que existem outras formas de prevenir doenças genéticas, tais como aconselhamento e/ou testes genéticos, terapia convencional ou somática. Relativamente ao problema da irreversibilidade da TGG, pode ser possível desenhar a TGS para actuar contra os erros da TGG, assim como utilizar muitas terapias convencionais: radiação, quimioterapia e terapia hormonal [5]. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 51 Será ainda possível minimizar os riscos da TGG para as gerações futuras, através do uso de transgenes que afectem somente o paciente mas não a sua descendência [5]. Poderá ser, também, viável a projecção de transgenes que possam somente ter efeito nas gerações futuras, mediante a toma de uma droga específica, ou seja, sejam apenas “disparados” quando necessários. Assim sendo, a aplicação da TGG fará sentido quando for mais segura, mais barata, e mais efectiva na prevenção de patologias para o indivíduo e, consequentemente para a sua descendência. Teoricamente, todos os genes humanos serão mapeados e identificados nas próximas duas décadas, bem como a descrição dos mecanismos genéticos de uma grande parte das doenças. Com isso, será possível tornar a medicina mais preventiva e, tanto o diagnóstico como a terapia serão mais específicos e eficazes, integrando-se no aconselhamento genético dentro do serviço médico. A expectativa é que a metodologia genética venha a ser uma abordagem básica para promover a saúde e controlar as doenças, e a TG, o método universal na prevenção de doenças e no desenvolvimento de tratamentos. N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 52 7. QUESTÕES ÉTICAS, SÓCIO-ECONÓMICAS E FINANCEIRAS DA TERAPIA GÉNICA HUMANA Nos últimos anos, a terapia génica tem sofrido grandes avanços a nível tecnológico, permitindo assim que esta modalidade terapêutica se torne mais segura. Todavia, à semelhança de outras intervenções biomédicas, apresenta várias questões sociais, éticas e financeiras que dificultam a sua aplicação prática. QUESTÕES ÉTICAS Várias questões éticas que a TG levanta enquanto método clínico, são paralelas às que qualquer terapia inovadora tem de enfrentar. Entre estas contam-se:
Antecipação de benefícios e riscos;
Estabelecimento de regras para a selecção de pacientes, informação do processo clínico ao paciente e legalização de protocolos;
Necessidade de preservação da privacidade e confidencialidade de pacientes. No entanto, de acordo com as limitações inerentes a esta tecnologia (ver ponto 3.6), são necessários esforços para garantir a segurança dos pacientes, em especial, possíveis consequências a curto e longo prazo. Como exemplo do primeiro caso, encontramos a morte de Jesse Gelsinger, já referida no ponto 2.3.. Em relação às consequências a longo- prazo, é evidenciado o caso em que duas crianças, que após terem encontrado cura para a doença IDSC, vieram a desenvolver leucemia. Deste modo, a TG deverá somente ser efectuada quando: i) existe uma hipótese razoável em beneficiar o paciente e ii) ausência de qualquer outro tratamento eficaz. TER AP IA GÉ NICA SOMÁT ICA VS . TER AP IA GÉ NICA GE RMIN AL Todos os ensaios clínicos correntes envolvem o tratamento de tecidos somáticos – TGS [6]. Esta forma de terapia, em princípio, não levanta um grande número de problemas éticos, visto se restringir somente aos indivíduos que foram submetidos ao tratamento. Contrariamente, a TGG envolve tratamento a nível de tecidos germinais, afectando permanentemente não só os próprios pacientes, como também, a sua descendência. Isto é, o pool genético humano será permanentemente modificado. Apesar destas alterações genéticas serem benéficas, caso provoque algum efeito adverso (ver ponto 2.5.3), este será perpetuado, atingindo um maior número de pessoas. É essencialmente esta preocupação ética que impossibilita, actualmente, a aplicação prática deste tipo de terapia. Porém, um dos argumentos que é utilizado a favor da TGG incide sobre a maior eficácia de uma única intervenção a nível germinal do que repetidas intervenções geração após geração (TGS) no tratamento de uma doença. Uma outra pergunta que é geralmente levantada, advém da negação dos direitos dos indivíduos da nova geração a qualquer escolha acerca da alteração da sua constituição genética. TER AP IA GÉNIC A VS . APE RF EIÇ OAMENT O A tecnologia inerente à TG possibilita igualmente a alteração de caracteres fenotípicos não associados a doenças, como por exemplo, a altura, a cor da pele, a memória e a inteligência de um indivíduo. Este tipo de modificação genética não terapêutica pressupõe o N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 55 [16]. Ali, R R et al. Gene transfer into the mouse retine mediated by an adeno-associated viral vector. Hum Mol Genet 1996; 5: 591-594 [17]. Neto, L Q. O que é o glaucoma? http://www.viasaude.com.br/artigos/glaucoma.htm (Consultado em Outubro/2003) [18]. Wright, A F. Gene therapy for the eye. Br J Ophthalmol 1997; 81:620-622 [19]. Gusella, J F. Huntington Disease. Nature ELS http://www.els.net (2001) [20]. Taylor, C. Huntington’s Disease – An Overview. Serendip. http://serendip.brynmawr.edu/bb/neuro/neuro98/202s98-paper1/Taylor.html (Consultado em Novembro/2003) [21]. Jankovic, J.; Current Medical Treatment of Huntington’s Disease. Baylor College of Medicine. http://www.bcm.tmc.edu/neurol/struct/hunting/huntp4.html (Consultado em Outubro/2003) [22]. Ashizawa, T.; New treatment strategies. Baylor College of Medicine. http://www.bcm.tmc.edu/neurol/struct/hunting/huntp8.html (Consultado em Outubro/2003) [23]. Transgenics and Huntington's Disease Future Directions Surgical Interventions http://dragon.zoo.utoronto.ca/~J03T0201A/f_surg.html (Consultado em Novembro/2003) [24]. Pattanayak, V. RNAi: Possible Therapies, Potential Breakthroughs. Journal of Young Investigators 2002; 7 [25]. Holmes, B. Gene therapy may switch off Huntington’s. New Scientist http://newscientist.com/news/news.jsp?id=ns99993493 (2003) [26]. Crittenden, J. RNA modalities in Huntington’s disease therapy. http://www.hdfoundation.org/workshop/200212Report.htm (Consultado em Outubro/2003) [27]. Crandall, K A. Human Immunodeficient Virus (HIV). Brigham Young University, Provo, Utah, USA. http://www.els.net [28]. Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology, 4th edition. 1996, Mosby [29]. Maidment, S L and Pilkington, G J. Brain Cancers. Nature ELS http://www.els.net (2001) [30]. Methodist Health Care System Cancer – Brain Tumors. http://www.methodisthealth.com/cancer/brain.htm (Consultado em Novembro/2003) [31]. John Hopkins Medicine. Glioblastoma Multiforme. http://www.brain- tumor.net/tumours/gliob.htm (Consultado em Novembro/2003) [32]. Lam, P Y P and Breakefied, X O. Potencial of gene therapy for brian tumors. Hum Mol Genet 2001; 10(7):777-787 [33]. Rochlitz, C F. Gene therapy of cancer. Swiss Med Wkly 2001; 131:4-9 N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A 56 BIBLIOGRAFIA ADICIONAL
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