A descoberta da ezetimiba: uma nova realidade para otratamento das hiperlipidemias

A descoberta da ezetimiba: uma nova realidade para otratamento das hiperlipidemias

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A descoberta da ezetimiba

A descoberta da ezetimiba: uma nova realidade para o tratamento das hiperlipidemias

Universidade Salgado de Oliveira

Wilson. Monteiro C. Júnior

Cláudio C. Cirne Santos Alan B. Silveira

Resumo. A pesquisa foi baseada na descoberta significante de um moderno inibidor de absorção de colesterol, a ezetimiba, para o tratamento das hiperlipidemias, evidenciando propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas. Dando enfoque principalmente aos estudos do planejamento que aconteceram desde o começo com os inibidores da ACAT, mostrando em primeira mão como foi descoberto o inibidor através de um protótipo, o SCH 48461 que possuía um mecanismo de ação que até então era desconhecido. Fazendo pesquisas para determinar a eficácia da ezetimiba sobre a ACAT, por acaso foi observado um mecanismo de ação diferente de outros compostos apresentados na pesquisa, que seria a inibição da absorção de colesterol localizado na borda da membrana da escova enterócitos no jejuno. A ezetimiba em estudos clínicos deram resultados significativos na diminuição do LDL-C nas seguintes patologias: a hipercolesterolemia (distúrbio autossômico dominante herdado geneticamente) e a sitosterolemia (resultado de um defeito em uma proteína de transporte). Os resultados positivos da pesquisa foram baseados na seguinte observação: Na hipercolesterolemia não existia uma variação na concentração de LDL-C, mas em outras espécies lipídicas secundárias como o HDL-C e os triglicerídios havia um equilíbrio. Em pacientes que apresentavam a sitosterolemia, A ezetimiba reduziu em 21% as espécies de LDL-esteróis (fitoesteróis e sitoesteróis), fazendo o uso do placebo para que fosse encontrado após esforços extenuantes o efeito desejado, ou seja, o equilíbrio na condição da saúde humana. Palavras-chave: 2-azetidinona; colesterol; inibidor de absorção do colesterol; hipercolesterolemia; sitosterolemia.

Abstract. The research was based on the discovery of a significant modern inhibitor of cholesterol absorption, the ezetimibe for the treatment of hyperlipidemia. Focusing mainly on studies of the planning that occurred from the beginning with the ACAT inhibitors, showing firsthand how the inhibitor was discovered by a prototype, the SCH 48,461 that had a mechanism of action that was hitherto unknown. Doing research to determine the effectiveness of ezetimibe on the ACAT, was found by chance a different mechanism of action of other compounds presented in the survey, which would inhibit the absorption of cholesterol located at the edge of the brush membrane enterocytes in the jejunum. The ezetimibe in clinical studies have significant results in the reduction of LDL-C in the following conditions: the hypercholesterolemia (genetically inherited autosomal dominant disorder) and sitosterolemia (result of a defect in a protein of transport). The positive results of the research were based on the following observation: In hypercholesterolemia there was no change in the concentration of LDL-C, but in other species such as the lipid secondary HDL-C and triglycerides had a balance. In patients who had the sitosterolemia, the ezetimibe reduced by 21% the species of LDL- sterols (phytosterols and sitoesterols), making the use of placebo was found to work after exhausting the desired effect, the balance on the condition of health human. Key-words: 2-azetidinone; cholesterol, cholesterol absorption inhibitor, hypercholesterolemia; sitosterolemia.

Atualmente a prevalência de doenças cardiovasculares tem crescido de modo exponencial, em países desenvolvidos e em desenvolvimento (Assmann et al, 1998). Segundo

Charlton & Durrington, (2008) estudos mostram a existência de novas drogas que inibem a absorção do colesterol intestinal, a reabsorção de ácidos biliares, a biogênese e o catabolismo de lipoproteínas e a heterotroca de ésteres de colesterol na circulação. Devido a forte correlação

A descoberta da ezetimiba entre os altos níveis de colesterol no sangue e alta incidência de doenças cardiovasculares existentes na espécie humana, o colesterol é o lipídio presente na natureza que mais recebeu publicações. Os papeis biológicos do colesterol são de compor a estrutura de membranas e ser um precursor de hormônios esteróides e ácidos biliares (Nelson & Cox, 2002). Nos vertebrados, a síntese do colesterol acontece no fígado. Uma pequena fração do colesterol sintetizado ali é incorporada na membrana dos hepatócitos em maior parte dele exportada em três formas: colesterol biliar, ácidos biliares e ésteres de colesterol (NELSON & Cox, 2002). A maioria dos lipídios oriundos da dieta, após sua absorção, é transportada no plasma por lipoproteínas (partículas formadas por uma capa hidrofílica constituída por fosfolipídios, colesterol livre e proteínas envolvidas por um núcleo hidrofóbico que contém triacilgliceróis e colesterol esterificado) e são constituídas por apoproteínas que exercem as seguintes funções: montagem da partícula, meio ligante aos receptores de membranas que captam para o interior da célula (apo B-48, apo B-100, e Apo-E) ou co-fatores enzimáticos (apo C-I, apo C-I, apo C-II) (Sales, 2006).

A produção desregulada de colesterol pode provocar doenças graves. Forti & Diament, (2006) relatam que concentrações elevadas de LDL-C e baixas de HDL-C no sangue são apresentadas como fatores principais para o desenvolvimento de doenças ateroscleróticas, podendo ser associadas ao perfil de pacientes com Doença Arterial Coronariana (DAC). As hiperlipidemias são anomalias provocadas por um aumento sérico de qualquer espécie de lipoproteína. Podem ser classificadas como primária (tabela 1) e secundária (relatada a uma causa tratável, exemplo, um efeito colateral de uma droga, hipotireoidismo, abuso alcoólico, ou diabetes), (Assmann et al, 1998).

Sabendo que a hipercolesterolemia desencadeia fatores exógenos, além de outras causas metabólicas endógenas e iatrogênicas podem ser relacionadas causas genéticas bem definidas que se tornam mais graves dependendo dos fatores de risco (genéticos ou não), assim definidos por Vieira, (2005). Exemplos de mutações podem ser vistas nos genes do receptor celular de LDL (LDLR) responsável pela manifestação da hipercolesterolemia familiar e mutações nos genes nos genes do transportador ligante de adenosina trifosfato (ABC), (dos tipos ABCG5 e ABCG8) que respectivamente codificam as proteínas esterolina-

1 e esterolina-2 que desencadearam a sitosterolemia (exacerbada captação dietética de fitosteróis) (Vieira, 2005).

Varias drogas são utilizadas para este fim:

Inibidores de HMG-CoA redutase (estatinas), agentes elevadores de HDL-C (niacina ou derivados de acido nicotínico), sequestrantes de ácidos biliares (colestiramina ou colestipol), e inibidores de absorção do colesterol (CAIs) (Tiqueside (6 PC 8.818; Pfizer), 2 (SCH 48461; Schering-Plough) (Rosenblum et al, 1998) (fig.2).

Sendo uma terapia para o tratamento da hipercolesterolemia, A ezetimiba representa uma descoberta significativa às correntes tecnológicas do tempo. Até mesmo com o continuo processo de descoberta, a natureza de um fármaco só poderia ser deduzida pela existência do padrão consistente da relação estrutura-atividade (Clader, 2003).

A descoberta do 14 (SCH 48461): O protótipo molde para a descoberta da ezetimiba

O programa de descoberta que conduziu ao ezetimiba começou com o desenvolvimento de modernos inibidores da ACAT (acil coenzima A colesterol acil-transferase) responsável por estar envolvida em uma variedade de eventos no tráfico do colesterol, inclusive na absorção em roedores. Enquanto em não-roedores ainda permanecia incerta a ação farmacológica quando está pesquisa começou (Sliskovic, et al 2002).

Por isso foi criada uma nova variedade de classes estruturais conhecidas como inibidores da ACAT testados in vivo e in vivo, e ativos em roedores mostrando um potencial para a baixa dos níveis de colesterol, (Clader, 2003).

A pesquisa começou com uma avaliação dos níveis de ésteres de colesterol (EC) e colesterol sérico (CS) em hamsters (Schitzer-Polokoff et al, 1991).

A espécie de hamsters alimentada com uma dieta rica em colesterol apresentou um aumento nos níveis de ésteres de colesterol (EC), embora in vivo estes animais se tornaram especialmente sensíveis à inibição da ACAT. E nos níveis de colesterol sérico (CS) não foram mudados porque a alimentação de colesterol nestes animais e a maioria destes inibidores possuíam efeitos mínimos em níveis de colesterol (Clader, 2003).

A descoberta da ezetimiba

A figura 1 mostra os perfis de alguns compostos precoces in vitro e in vivo, como o 1 e 2 (Clader et al,1995;Vaccaro et al,1996) , e também o inibidor da ACAT 3 (CL-976) (fig.3) (Sliskovic, et al 2002).

Fig 1. Protótipo de inibidores de ACAT, extraído do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor ‘‘ (Clader, 2003)”.

Segundo Clader et al, (1995) & Vaccaro et al (1996) a limitação conformacional do composto 1 conduziu para o indol 2, mostrando em ambos um aumento significativo na potência in vitro em hamsters alimentados com colesterol. Além do 2, vários análogos estavam sendo preparados para avaliação dos resultados nos testes in vitro e in vivo (Clader, 2003). Entre estes estão a azetidinona 4 proposta por Burnett et al,(1994). Os compostos da figura 4 foram preparados por uma condensação éster-enolato para dar origem a azetidinona 5 que então era desprotegida por oxidação, reduzida e acilada com uma variedade de ácidos (Clader, 2003).

Na prática, a condensação éster-enolato resultou na síntese da azetidinona 5 com um rendimento desejado, acompanhado por uma quantia pequena do subproduto 6, aparentemente derivado de uma desprotonação do 5 e seguido de uma condensação de Claisen com um fenilacetato de etila como material inicial (Clader, 2003). Nenhum dos compostos apresentados era um potente inibidor da ACAT. Embora o composto 6 apresentasse uma modesta inibiação na ACAT com um IC50 de 7µM. Apesar de uma inibição relativamente fraca, no ensaio in vivo, o composto

6 mostrou uma inibição desejada nos hamsters alimentados com colesterol (Clader, 2003).

Fig 2. Design e a síntese das azetidinonas, extraído do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor” (Clader, 2003)

Os seguimentos iniciais desta estrutura descrita por Burnett et al, (1996) (fig. 3) demonstram que o 6 não era um achado isolado. Por isso, vários análogos do 6 exibiram um perfil semelhante na fraca inibição sobre a ACAT, acompanhando por um efeito modesto mas reprodutível em EC e CS nos hamsters (fig 3). Com base nestas observações descritas por Burnett et al, (1996) a atividade inibitória desconsiderada de análogos subseqüentes sobre a ACAT otimizando o foco sobre os ensaios in vivo, guiados somente pela atividade no hamster alimentado com colesterol (Clader et al, 2003). Com a descoberta das azetidinona 13 e 14 (SCH 48461), novos objetivos foram traçados com relação a estes compostos como pontos de partida para o trabalho subseqüente sobre os protótipos azetidinonas de absorção de colesterol. Além de bloquear acumulo de ésteres de colesterol hepático em hamsters, o 14 reduziu também os níveis de colesterol sérico em ratos, cachorros e macacos (em particular atividade nos macacos Rhesus), alimentados com colesterol (Clader, 2003).

Em experimentos realizados Salisbury et al 1995, mostram os efeitos do 14 em macacos rhesus alimentados em uma dieta de colesterol por quatro semanas. Os controles destes animais mostraram uma hipercolesterolemia, que depois de três semanas era completamente bloqueada por doses de 1mg/kg de 14 administrados na dieta. Quando os animais do controle foram tratados por 1mg/kg de 14, os níveis de colesterol destes animais retornaram quase a linha basal, enquanto a retirada da droga causou uma elevação gradual nos níveis de colesterol em um mesmo período de tempo (Clader, 2003).

A descoberta da ezetimiba

Fig 3. Relações Estrutura-atividade precoce das Azetidinonas. Extraido do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor” (Clader, 2003)

Além disso, Salisbury et al, (1995) demonstraram que os inibidores da ACAT e o 14 tinham efeitos diferentes em níveis de colesterol intracelular (Salisbury et al, 1995). Em experimentos, o inibidor da ACAT 3 bloqueou a acumulo de ésteres de colesterol embora não possuía nenhum efeito no colesterol livre da parede intestinal dos hamster. Em contrapartida, o 14 inibiu a acumulo de colesterol esterificado e não-esterificado (Clader, 2003). Por isso a redução dos níveis de ésteres de colesterol era completamente feita, devida à redução do colesterol proveniente da alimentação. Assim os dados in vitro e a farmacologia in vivo sugerem que os inibidores azetidinona de absorção de colesterol tenham um mecanismo incerto que estaria anterior a ACAT (Clader, 2003.)

Estudos no protótipo 14 (SCH 48461): Ao acaso, a descoberta da ezetimiba

Segundo Clader, (2003), com a descoberta do 14 (SCH 48461) um novo objetivo foi traçado para entender a natureza deste composto. Os efeitos do 14 (SCH 48461) e análogos teriam de apresentar uma interação e objetivo molecular.

Entre as provas mais difíceis, seriam abordados os efeitos de conformação de análogos limitados como 15-18 (fig. 4). (Dugar et al,1995; Dugar et al, 2000).

Fig. 4. A limitação conformacional dos análogos de 14. Extraido do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor” (Clader, 2003)

Por isso, Van Heek et al 1997, criaram um protocolo experimental para o 14, onde se dividiu em duas partes. Na primeira, foi administrado em ratos o compostos SCH 48461 marcado com trítio

(3 H) na vesícula biliar para, assim, a bile ser reunida por uma cânula através da vesícula dando origem ao metabólito biliar (contendo a maioria dos metabolitos do 14) . E a outra dosada dentro do duodeno, onde foram feitos controles em outros animais cuja bile também foi coletada por uma cânula intraduodenal, e em seguida foi acrescida o

3 H com (SCH 48461) a chamada bile original para correspondência à atividade específica do metabólito que estava contida a bile (Clader, 2003).

Na segunda parte, tanto o metabólito bíliar quanto a bíle original foram dosadas intraduodenalmente em um segundo grupo de cobaias desviadas com colesterol marcado 14C, e as contagens da soma de 14C e 3H em vários tecidos seriam medidos, onde ambos os efeitos

A descoberta da ezetimiba farmacológicos bem como as disposições da droga também poderiam ser medidas em uma única experiência. (Clader, 2003).

Em uma terceira etapa do controle de 2ª parte, a bílis original foi dosada em cobaias não-desviadas onde as formações de metabolitos ativos poderiam contribuir para a atividade (Clader, 2003). Os resultados foram que a bile original reduziu o aparecimento de colesterol marcado com 14 C no plasma e no fígado, e o metabólito biliar era mais efetivo em níveis reduzidos de 14 C comparável ao

composto 14 aplicado nas cobaias

Os mesmos dados levantaram um questionamento sobre a identidade dos metabólitos ativos. Para resolver está questão, o metabólito bíliar era fracionado por HPLC e cada fração foi avaliada (Clader, 2003). Com base no aparecimento do 14C-colesterol no plasma, os dados mostraram o tamanho da atividade residida na fração 6 e a análise subseqüente identificou que esta fração estava principalmente composta do glucuronídio de combinação 19 (Fig 5), um metabólito fenólico do SCH 48461. Para completar a experiência, as atividades do metabólito da bíle, nas frações 6 e 19 eram autênticas comparados em ratos na cânula desviada na vesícula biliar (Clader, 2003).

Fig 5 . A representação do composto 19. Extraido do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor” (Clader , 2003)

Nos dados mostrados na figura 6 observamos que a atividade do 19 é idêntica a da fração 6 e ambos são substancialmente mais ativos que a mistura de metabólitos. Foi sugerido que esses dados da atividade in vivo do SCH 48461 fossem usados para a formação do 19. Além disso, eles sugeriram que metabolismo do 14 (SCH 48461) para o 19 ajudou a localizar os compostos ativos no intestino, mostrando o local de ação(Clader, 2003).

Fig 6. Eficácia de fração 6 contra 19 em um tubo desviado na bílis em ratos. Extraido do texto “The Discovery of Ezetimibe: A View from Outside the Receptor” (Clader , 2003)

Entre os vários metabólitos ativos do 14, uma grande variedade de fenóis foi produzida por desalquilação de qualquer grupo ou ambos metoxi por hidroxilação aromática. Ambos, fenol 20 e o bifenol 21 mostraram atividades significativas nos hamsters alimentado com colesterol (Clader, 2003).

Por outro lado, o fenol 2 era menos ativo que o 14 (SCH 48461), sugerindo que o metabolismo poderia ser prejudicial à atividade (fig.13). Além dos fenóis, outra rota de metabolismo envolveu hidroxilação da cadeia lateral do 3-fenilpropil para produzir álcoois e cetonas. O (S)-álcool 23 era substancialmente mais ativo que o SCH 48461, e o (R)-isômero 24 era menos ativo (Clader, 2003).

A cetona correspondente à atividade do composto 25 possuía atividade intermediaria. Por isso, tem se sugerido que o metabolismo para o (S)-álcool, não seja exigida para atividade química, o que traria melhorias para a atividade do composto (Clader, 2003).

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