Apoptose

Apoptose

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Até recentemente os cientistas acreditavam que as células só morriam quando agredidas por fatores externos, por um processo chamado necrose. Agora, sabe-se que existe outra forma: o suicídio celular programado, necessário para eliminar células supérfluas ou defeituosas. Esse fenômeno biológico, batizado de apoptose, tem papel importante em diversos processos vitais e em inúmeras doenças, e sua investigação pode ajudar a desenvolver novas terapias e medicamentos.

Maria de Fátima Horta Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais John Ding-E Young Universidade Rockefeller (Nova York, Estados Unidos)

Quando a célula programa a própria morte

Quando a célula programa a própria morte junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 39 junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 39

IdØias como morte e autodestruiçªo sªo sempre sinistras e trÆgicas. Sempre? Se mudarmos o ponto de vista, veremos que nªo, pois na natureza tais conceitos podem muitas vezes significar a vida. Por mais cruel que pareça, o extermínio dos indivíduos mais fracos de uma espØcie por predadores ou a morte espontânea daqueles que tŒm defeitos letais ou seja, a sobrevivŒncia dos mais aptos ajuda essa espØcie a se perpetuar forte e sadia. Esse mecanismo de seleçªo ocorre tambØm em níveis menos visíveis, como o das cØlulas.

Muitas cØlulas de um organismo morrem para que o conjunto sobreviva. Assim como Ø preciso gerar novas cØlulas para manter processos vitais, Ø imprescindível eliminar as supØrfluas ou defeituosas. No indivíduo adulto, se a multiplicaçªo das cØlulas nªo Ø compensada de modo preciso por perdas, os tecidos e órgªos crescem sem controle, o que pode levar ao câncer. O que estudos recentes revelaram, porØm, Ø que muitas cØlulas carregam instruçıes internas para cometer suicídio no momento em que nªo sªo mais œteis ao organismo. Tais instruçıes sªo executadas, como um programa, quando certos comandos sªo acionados.

Essa morte programada só atraiu o interesse dos cientistas nos œltimos anos, mas sua compreensªo jÆ avançou muito. A morte de cØlulas jÆ era conhecida hÆ muito tempo, mas acreditava-se que era sempre prejudicial ao organismo. Hoje, ao contrÆrio, sabese que seres pluricelulares só atingem sua forma final porque eliminam de modo seletivo certo nœmero de cØlulas. A rª e os insetos sªo exemplos bem familiares (figura 1). A rª inicia a vida como girino, forma adaptada ao ambiente aquÆtico.

Depois, ganha outras estruturas para viver em terra e ao mesmo tempo perde nadadeiras, guelras e a cauda. Essas perdas decorrem da morte das cØlulas. Nos insetos, a mudança de larva para animal adulto (de lagarta para borboleta, por exemplo) exige a morte de milhıes de cØlulas.

Outros exemplos sªo menos visíveis. Durante a fase embrionÆria de todos os vertebrados, certos neurônios devem enviar projeçıes longas e finas (axônios) atØ um mœsculo, que irÆ controlar. Se um neurônio nªo faz essa ligaçªo ou a faz de modo inadequado, estÆ fadado a morrer. A formaçªo da mªo humana segue processo semelhante. No início, Ø um apŒndice arredondado, sem dedos definidos.

Estes sªo formados pela multiplicaçªo de algumas cØlulas, enquanto as que estªo nos espaços entre eles recebem o comando para morrer. Se isso nªo ocorresse, os dedos de nossas mªos seriam ligados por uma membrana, como nos patos.4

NECROSE: A CÉLULA COMO VÍTIMA Nos exemplos dados, a morte das cØlulas Ø um proces- so fisiológico normal, totalmente regulado. Mas as cØlulas tambØm morrem de modo nªo-fisiológico, o que causa a maioria das doenças. A morte Ø patológica ou acidental quando a cØlula Ø impedida de manter seus processos vitais por lesıes físicas ou químicas causadas por fatores externos, como temperaturas extremas, radiaçªo, traumas, produtos tóxicos e falta de oxigŒnio (como no infarto do miocÆrdio e na gangrena). As lesıes podem ter ainda origem biológica, como nas infecçıes por bactØrias ou vírus. Esse tipo de morte celular, o œnico conhecido pelos cientistas mais antigos, Ø chamado de necrose.

A necrose Ø claramente visível por microscopia eletrônica (figura 2): a cØlula incha e as organelas do citoplasma, em particular as mitocôndrias, sªo danificadas, mas o nœcleo nªo sofre alteraçıes significativas. Tais lesıes impedem o controle do equilíbrio interno: a Ægua e alguns íons (em especial sódio e cÆlcio), normalmente bombeados para fora, fluem livremente para dentro da cØlula, que incha e se rompe.

A ruptura libera no tecido vizinho o conteœdo celular, rico em proteases (enzimas que cortam outras proteínas) e outras substâncias tóxicas. AlØm da toxicidade direta para as cØlulas vizinhas, o derrame gera substâncias que atraem cØlulas do sistema imune, causando intensa reaçªo inflamatória: alguns tipos de glóbulos brancos (em especial neutrófilos e macrófagos) convergem para o tecido em necrose e ingerem as cØlulas mortas. A inflamaçªo, típica da necrose, Ø importante para limitar infecçıes e remover restos de cØlulas, mas a atividade e as secreçıes dos glóbulos brancos podem tambØm danificar tecidos normais vizinhos, às vezes de maneira devastadora.

APOPTOSE: O SUICÍDIO SILENCIOSO A morte celular fisiológica (figura 3) Ø totalmente distinta da necrose. Em primeiro lugar, a cØlula nªo incha. Ao contrÆrio, encolhe-se, destaca-se das cØlulas vizinhas e começa a apresentar bolhas em sua

Figura 1. O desenvolvimento de seres multicelulares depende da morte programada de certas células superfície (processo chamado de zeiose). A membrana e as organelas mantŒm sua estrutura intacta e nªo hÆ alteraçıes evidentes no citoplasma. O nœcleo, porØm, sofre mudanças dramÆticas: normalmente dispersa, a cromatina (conjunto dos cromossomos, que contŒm o material genØtico) forma um ou mais aglomerados nas bordas internas da membrana nuclear. Isso basta para levar as cØlulas à morte. As que demoram a morrer podem sofrer outras mudanças: o nœcleo parte-se e a cØlula tambØm divide-se em estruturas ( corpos apoptóticos ) contendo porçıes do nœcleo, tomando uma forma inconfundível ao microscópio eletrônico.

Em 1972, o australiano John Kerr e os colaboradores escoceses Andrew Wyllie e Alastair Currie descreveram os diferentes aspectos das cØlulas na morte programada e na patológica. Para distingui-los, batizaram o primeiro de apoptose , em oposiçªo à necrose. Em grego arcaico, a palavra apoptose significa o ato de cair , como caem as pØtalas das flores e as folhas das Ærvores no outono, e foi escolhida porque sugere perdas (a morte celular, no caso) benØficas, necessÆ- rias ao bom funcionamento e à sobrevivŒncia do organismo.

Após outros estudos, os cientistas sugeriram que a morte celular programada ocorre nªo só durante o desenvolvimento, mas tambØm em organismos maduros, ao longo da vida. TambØm sugeriram que na apoptose, ao contrÆrio do que acontece na necrose, a cØlula participa da própria destruiçªo, e que poderia haver ligaçªo entre a ativaçªo incorreta do suicídio celular e doenças degenerativas (como o mal de Alzheimer) e entre sua inibiçªo incorreta e doenças replicativas (como o câncer).

Uma característica marcante Ø que a apoptose Ø silenciosa . Nªo hÆ, como na necrose, o alvoroço da inflamaçªo. Em geral, as cØlulas apoptóticas sªo reconhecidas por macrófagos (um tipo de glóbulo branco presente em todos os tecidos) e ingeridas antes que se desintegrem. Isso evita o derrame do conteœdo celular e, assim, nªo hÆ inflamaçªo e lesªo

Ao se transformar em rã adulta, o girino elimina as células da cauda, das guelras e das nadadeiras

No embrião humano, os dedos das mãos são formados pela morte das células das membranas interdigitais

Quase todas as células da lagarta e da crisálida morrem quando ela se torna borboleta

junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 41 do tecido, garantindo o seu funcionamento normal.

Fato interessante Ø que certas cØlulas apoptóticas nªo sªo removidas logo, continuando no local às vezes por toda a vida. É o caso dos queratinócitos, cØ- lulas da camada externa da pele. Ao migrar de camadas mais profundas para a superfície, eles morrem por apoptose, mas no processo substituem seu conteœdo pela proteína queratina e ganham uma capa impermeÆvel. Assim, a camada protetora mais externa da pele Ø feita de cØlulas mortas, descamadas e trocadas por outras a cada 21 dias, em mØdia. O cristalino (a lente) dos olhos tambØm Ø formado por cØlulas mortas, que substituíram a maior parte de seu citoplasma por proteínas denominadas cristalinas.

As idØias inovadoras geradas pelo grupo de Kerr no início dos anos 70 passaram despercebidas por mais de uma dØcada, atØ que suas previsıes começaram a ser confirmadas. Hoje, inœmeros cientistas pesquisam a apoptose e, embora muitas questıes continuem sem resposta, vÆrios princípios bÆsicos jÆ foram descobertos.

AS ‘ARMAS’ USADAS PELAS CÉLULAS Certas proteases, recentemente chamadas de caspa- ses (nome derivado de cisteína-protease que cliva corta após resíduos de Æcido aspÆrtico) tŒm papel central na apoptose, em todo tipo de cØlula e em todo organismo multicelular jÆ estudado. A primeira enzima dessa família descrita em mamíferos foi a ICE (interleukin-1b converting enzyme), hoje caspase 1. O que levou à identificaçªo da ICE foi sua funçªo de ativar a interleucina-1b, proteína importante no sistema imune, mas depois ela atraiu maior atençªo por seu papel na apoptose.

Outras enzimas, com características semelhantes, foram identificadas depois: a família jÆ tem 14 integrantes. De início, atribuiu-se à caspase 1 um papel primordial na apoptose, mas estudos recentes, com camundongos nocautes para essa enzima (que nªo a produzem), mostraram que vÆrias formas de apoptose ocorrem na sua ausŒncia. Em alguns casos, no entanto, a caspase 1 Ø preponderante. Uma caspase pode clivar outras e esse corte parece ser essencial à ativaçªo dessas enzimas. Ao ser ativada, uma caspase iniciadora cliva outras, em seqüŒncia, atØ gerar uma caspase executora. Esta destrói proteínas essenciais à cØlula, ativa proteínas tóxicas ou destrói proteínas que protegem a cØlula da apoptose. Todos os casos levam à morte celular.

VÆrios experimentos em laboratório sugerem uma hierarquia na ativaçªo das caspases, mas essa hierarquia e as caspases envolvidas podem diferir, dependendo do modo de induçªo da apoptose. A caspase 8 ou a caspase 10, dependendo do tipo de estímulo que a cØlula recebe, sªo fortes candidatas a caspases iniciadoras, e hÆ indícios de que, em geral, a ativaçªo da caspase 3 e da caspase 7 precede a ativaçªo da caspase 6 (caspases executoras).

PROGRAMA LETAL Na grande maioria das cØlulas em apoptose observa-se a destruiçªo do material genØtico, o Æcido desoxirribonuclØico (DNA). CØlulas eucariotas (com DNA contido em nœcleo limitado por membrana) tŒm cromossomos formados por unidades repetitivas, os nucleos-

Figura 3. Na apoptose, a célula encolhe, bolhas começam a se formar e a cromatina é compactada, formando massas concentradas nas bordas internas do núcleo, que se parte, levando à formação dos corpos apoptóticos

Figura 2. Na necrose, a célula e as organelas citoplasmáticas incham, enquanto o núcleo mantém-se relativamente intacto, e depois a célula rompe-se, liberando o conteúdo de seu citoplasma junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 41 4 somas (figura 4). Antes da morte da cØlula, o DNA Ø cortado por enzimas (endonucleases) em regiıes específicas entre os nucleossomas. Como cada unidade dessas tem cerca de 200 pares de bases (nucleotídeos), os fragmentos de DNA gerados tŒm esse nœmero de pares de bases ou mœltiplos dele.

Assim, se o DNA de uma cØlula apoptótica for analisado por eletroforese, tØcnica que separa os fragmentos por tamanho, serÆ vista uma escada (figura 5), na qual os degraus indicam o tamanho de fragmento: 200 pares de bases, 400, 600 etc. A presença dessa escada Ø usada como uma marca da apoptose, embora ainda haja controvØrsia sobre se todas as cØlulas em apoptose sofrem fragmentaçªo do DNA.

VÆrias proteínas sªo apontadas como alvos das caspases, mas ainda nªo foi estabelecida uma relaçªo direta entre o corte dessas proteínas e a morte celular. O primeiro vínculo entre a açªo de uma caspase e o corte do DNA foi constatado hÆ pouco. A caspase 3 corta uma proteína (ICAD, de inhibitor of caspase-activated dnase) normalmente ligada a uma endonuclease (CAD) no citoplasma, ativando essa enzima, que entra no nœcleo e começa a cortar o DNA. Outra relaçªo direta jÆ identificada Ø o corte, tambØm pela caspase 3, da gelsolina, proteína ligada aos filamentos de actina (parte do citoesqueleto, que mantØm a estrutura normal da cØlula). Esse corte danifica os filamentos e a cØlula perde sua forma, o que leva à apoptose.

OS GATILHOS DO SUICÍDIO CELULAR A apoptose pode ser acionada por vÆrios tipos de

gatilhos. A ausŒncia dos sinais químicos que mantŒm a cØlula em atividade e multiplicaçªo (os chamados fatores de crescimento) pode ser um deles. No caso da cauda do girino, o gatilho para o suicídio Ø o aumento da concentraçªo do hormônio tiroxina, liberado por certas cØlulas da rª. CØlulas expostas em laboratório a altas concentraçıes de tiroxina morrem mesmo que o animal nªo tenha chegado à fase adulta. No entanto, se as concentraçıes de tiroxina sªo mantidas abaixo dos níveis normais a cauda persiste, mesmo na rª adulta.

Dois exemplos interessantes de induçªo de apoptose estªo no sistema imune. Um deles Ø a morte prematura de linfócitos T capazes de atacar o próprio organismo que os gerou (figura 6). Originados na medula óssea, os linfócitos T amadurecem na glândula timo (daí o T ), entram no sangue e no sistema linfÆtico e passam a ter papel crucial na defesa contra microrganismos. Isso se dÆ por meio de molØculas receptoras produzidas em sua superfície, durante sua maturaçªo, que reconhecem substâncias estranhas e as combatem. Ainda no timo, porØm, algumas dessas cØlulas produzem receptores que se ligam a substâncias do próprio organismo, o que levaria à auto-agressªo, se elas fossem liberadas. Normalmente, porØm, só saem do timo linfócitos que se ligam a componentes estranhos. Os demais, inadequados , sªo selecionados e levados ao suicídio, graças à apoptose.

O outro exemplo estÆ na açªo dos linfócitos T chamados de citotóxicos contra uma infecçªo virótica. Os vírus só sobrevivem se estiverem dentro de uma cØlula. Eles usam a mÆquina celular para produzir suas próprias proteínas e gerar novos vírus, que invadem outras cØlulas sadias. CØlulas infectadas, porØm, expıem na superfície (figura 7) componentes do vírus, reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicos. Com isso, o linfócito liga-se à cØlula-alvo e a bombardeia com pelo menos dois tipos de proteínas que, juntas, levam à morte celular (por necrose ou apoptose), evento descrito em 1991 em estudo do qual um dos autores (Young) participou.

Uma dessas proteínas Ø a perfurina, que se insere na membrana celular e forma poros ( furos ) que expıem o interior da cØlula, como demonstrado pelos autores, junto com outros grupos. O dano à

Figura 4. O corte dos nucleossomas, formados pelo enrolamento do DNA em proteínas nucleares (histonas), libera fragmentos de cerca de 200 pares de bases ou múltiplos desse número membrana Ø suficiente para levar a cØlula à necrose. Outros grupos revelaram depois que a segunda proteína, a enzima granzima B, liga-se à superfície da cØlula-alvo e entra no citoplasma. Ali, essa enzima ativa a cascata das caspases, provavelmente ao clivar a caspase 10, induzindo a apoptose. Mas as cØlulas ci-

Figura 5. Os fragmentos de DNA de uma célula apoptótica separados por eletroforese (manchas escuras) formam uma ‘escada’, na qual os ‘degraus’ indicam o número de pares de bases (200, 400, 600 etc.) de cada fragmento

junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 43 totóxicas tambØm induzem apoptose por meio da proteína Fas, presente na membrana de vÆrias cØlulas. Essa proteína mantØm uma parte dentro da cØlula e outra fora, e pode ligar-se a outra proteína, a Fasligante (FasL), presente na membrana dos linfócitos T citotóxicos. Quando o linfócito liga-se à cØlula-alvo, a FasL une-se à Fas e altera a forma da parte externa dessa œltima. Essa alteraçªo faz com que a parte interna ative a caspase 8, iniciando a cascata de caspases. Em certos casos, fatores acidentais podem ser o gatilho do programa de morte.

OS GENES SÃO OS RESPONSÁVEIS CØlulas insubstituíveis, como neurônios e fibras musculares esquelØticas, sªo mais resistentes à apoptose porque sua perda seria desastrosa para o organismo. JÆ cØlulas substituídas com facilidade, como as do sangue, sªo mais propensas a morrer desse modo. Mas o que determina que serªo mais suscetíveis ou mais resistentes?

As primeiras evidŒncias de que os mecanismos do suicídio celular sªo regulados por certos genes vieram dos estudos pioneiros de Robert Horvitz e colaboradores (no Massachusetts Institute of Technology, nos Estados Unidos) com o Caenorhabditis elegans. Esse pequeno verme de vida livre no solo Ø um modelo excelente para esse tipo de estudo por ter apenas 1.090 cØlulas somÆticas (jÆ diferenciadas), das quais 131 morrem durante seu desenvolvimento. Inofensivo ao homem, o C. elegans reproduz-se rapidamente em laboratório e Ø transparente: cada cØlula pode ser observada.

Outra vantagem Ø que todos os seus genes sªo conhecidos (estudo concluído em dezembro do ano passado). Isso permitiu identificar, em vermes mutantes, os 14 genes com algum papel na morte programada das cØlulas, batizados de ced (de cell death abnormal). Para a destruiçªo das 131 cØlulas, apenas dois (ced-3 e ced-4) sªo necessÆrios: muta- çıes em um deles bloqueiam a apoptose, e as cØlulas do C. elegans que morreriam continuam saudÆ- veis. O ced-3 Ø semelhante ao gene humano que codifica a caspase 1, sugerindo que descendem de um ancestral comum.

Que mecanismo faz com que só as cØlulas supØrfluas do C. elegans sejam eliminadas? A resposta parece estar em outro gene, o ced-9, que impede a açªo dos dois genes suicidas, evitando a apoptose. Esse gene de sobrevivŒncia parece ser expresso normalmente em muitas cØlulas que nªo devem morrer, talvez para protegŒ-las. Em vermes mutantes, sem um ced-9 ativo, muitas cØlulas que estariam no adulto morrem por apoptose. Ao contrÆrio, em mutantes que expressam em excesso esse gene certas cØlulas supØrfluas sªo poupadas da morte.

Um gene dos mamíferos muito parecido com o ced-9 Ø o que codifica a proteína Bcl-2 (de B-cell lymphoma), que tambØm protege as cØlulas da morte programada. VÆrios trabalhos vŒm sugerindo que a Bcl-2 e outras proteínas da mesma família regulam, em grande parte, a suscetibilidade celular à morte programada. Essa funçªo começou a ser compreendida pelo estudo de portadores do linfoma de cØlulas B, tipo de leucemia que só afeta esses linfócitos. Descobriu-se que nessas cØlulas tumorais o gene responsÆvel pela Bcl-2 tem atividade excessiva, levando à produçªo de grandes quantidades da proteína. Em geral, os oncogenes (genes que causam câncer se expressos em excesso) promovem a divisªo celular, mas a superexpressªo da Bcl-2 nªo tinha esse efeito, o que intrigou os cientistas.

O mistØrio foi desfeito com a descoberta de que a

Bcl-2 impede a morte celular, o que tambØm leva, como a divisªo descontrolada, ao acœmulo de cØlulas anormais e, com isso, ao câncer. Outros estudos mostraram que o efeito protetor da Bcl-2 Ø geral, evitando a apoptose em diversos tipos de cØlulas, tanto de modo direto (bloqueando complexos de

Figura 6. Seleção no timo de linfócitos úteis: os que se ligam a componentes próprios (das células ‘apresentadoras de antígenos’) recebem o sinal para morrer, e os demais escapam da morte e saem do timo para os órgãos linfóides periféricos junho de 1999 • CIÊNCIA HOJE • 43 caspases) quanto indireto (impedindo a liberaçªo para o citoplasma de componentes da mitocôndria, capazes de ativar a caspase 3). O excesso de Bcl-2, embora nªo seja suficiente para causar câncer, favorece a açªo de outros oncogenes.

Certas cØlulas normais produzem níveis relativamente altos de Bcl-2. Acredita-se que isso preserva cØlulas cuja morte seria devastadora para o organismo. O excesso de proteçªo, porØm, tem um preço: quando se tornam cancerosas, elas costumam gerar tumores mais agressivos, jÆ que resistem mais à morte programada. Isso parece ocorrer com os melanócitos. Tais cØlulas, produtoras do pigmento melanina, que escurece a pele e ajuda a evitar a absorçªo de doses letais de luz solar, precisam ser protegidas porque sua morte precoce ameaçaria outras cØlulas da pele. Mas por causa dessa resistŒncia à apoptose, os melanócitos, se hÆ algum dano nos genes, geram tumores (melanomas) mais agressivos e que se espalham rapidamente.

Outro gene envolvido na apoptose tambØm foi detectado em estudos de tumores. O câncer surge quando cØlulas recØm-formadas apresentam mutaçıes simultâneas em genes que controlam o crescimento e a sobrevivŒncia. Esses defeitos , se pouco extensos, podem ser corrigidos por enzimas especializadas. Em geral, se a mutaçªo Ø irreparÆvel, ocorre o suicídio celular (segundo o princípio melhor morta que errada ). O processo Ø comandado por um gene, presente em cØlulas normais, que codifica a proteína p53 (o nome refere-se à massa da molØcula: 53 quilodÆltons). Ao contrÆrio do gene Bcl-2, o p53 desencadeia a apoptose. CØlulas mutantes, sem esse gene, nªo sofrem apoptose. Elas vivem mais tempo, acumulam mais mutaçıes e multiplicam-se sem controle, gerando tumores. Por impedir isso, protegendo o organismo do câncer, o p53 foi chamado de gene supressor de tumores.

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