Cristalografia de macromoléculas

Cristalografia de macromoléculas

Universidade Federal de Alfenas

Cristalografia de Macromoléculas

Diego Roberto Sousa Lima

Isabela Maria Ferreira Lopes

Jennifer Jacon Tavarez

Richard Rampazzo

Alfenas, 2009

Cristalografia de Macromoléculas

1. Introdução

A Cristalografia se encontra representada em um número de áreas científicas. Ela nasceu como uma ciência dedicada ao estudo dos cristais e, portanto, está intimamente ligada aos minerais, mas suas raízes mais profundas podem se encontrar na matemática e no estudo das simetrias, que lhe dão um marco formal e teórico. Vários séculos de desenvolvimento levaram a teoria dos grupos cristalográficos junto com os métodos de difração e espalhamento de raios X a criar uma ciência multidisciplinar por excelência.

A cristalografia de macromoléculas é a ciência destinada a estudar sistemas biológicos através da determinação da estrutura tridimensional em nível atômico de importantes classes de moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucléicos e vírus. Informações sobre a estrutura tridimensional de uma molécula podem ser obtidas por várias metodologias: difração de raios X por monocristais, difração de nêutrons por monocristais, ressonância magnética nuclear, espalhamento de raios X a baixo angulo [SAXS] em solução, microscopia eletrônica, modelagem teórica, entre outros. Dentre essas, o método cristalográfico apresenta-se como o mais adequado devido à alta resolução com que se pode descrever a densidade eletrônica. O método cristalográfico tem contribuições relevantes em diversas áreas, dentre as quais se podem citar Genômica, Proteômica e Bioinformática.

A estrutura tridimensional de macromoléculas em resolução atômica, o que chamamos de estrutura cristalográfica entra como uma informação essencial para o entendimento detalhado de vários processos biológicos como catálise enzimática, infecção viral, divisão celular e transferência de informação genética, por exemplo, além de ter aplicação no planejamento reacional de fármacos e vacinas.

A estrutura e a função de uma macromolécula são propriedades intimamente ligadas. Os segredos dos mecanismos de reconhecimento e respostas das macromoléculas biológicas dependem de suas estruturas químicas, e ainda de suas estruturas tridimensionais.

Os cristais de macromoléculas biológicas são diferentes dos cristais de pequenas moléculas em vários aspectos. Eles diferem em tamanho, cristais de macromoléculas são normalmente bem menores, dificilmente excedem 1mm3 em volume. Outra diferença é que cristais de macromoléculas biológicas são bem mais frágeis e possuem um alto conteúdo de solvente. A fragilidade dos cristais de macromoléculas biológicas é uma conseqüência das fracas interações entre as macromoléculas biológicas dentro da rede cristalina e do alto conteúdo de solvente nestes cristais (de 20% a mais de 75%).

As ligações fracas que mantêm a estrutura cristalina destas macromoléculas biológicas são do tipo hidrofóbicas e ligação de hidrogênio. Por esta razão, os cristais de macromoléculas biológicas devem ser mantidos em um ambiente saturado de solvente, caso contrário, a desidratação conduzirá à quebra destas ligações fracas e, conseqüente, a destruição dos cristais. O alto conteúdo de solvente, contudo, tem conseqüências úteis, pois os canais de solvente nos cristais de macromoléculas biológicas permitem a difusão de pequenas moléculas, uma propriedade usada na preparação de derivados isomorfos e de complexos binários de proteínas e ligantes. Outra característica dos cristais de macromoléculas são as grandes dimensões de suas celas unitárias, se comparadas com as dimensões das celas unitárias das pequenas moléculas. Cristais de macromoléculas podem ter parâmetros de cela unitária de até algumas dezenas de milhares de ângstrons.

Um grande desenvolvimento nos métodos de resolução de estruturas tem permitido que o tempo de resolução de estruturas fosse reduzido de anos para meses e em alguns casos dias e até mesmo horas. A principal técnica para resolução da estrutura tridimensional de macromoléculas como um todo tem sido a cristalografia por difração de raios X, e até hoje é a técnica principal para investigação da estrutura tridimensional de macromoléculas biológicas.

Quando os raios X incidem sobre o cristal, estes interagem com os elétrons dos átomos que o compõe. Os raios X, como qualquer onda eletromagnética, provocam uma força que é proporcional ao campo elétrico da radiação. Essa força acelera os elétrons que por sua vez espalham a radiação em todas as direções.

Para o uso de técnicas de difração de raios X é necessário o uso de cristais com pequenas dimensões, por volta de 0,2 mm, contudo com uso de fontes de raios X bem intensas, tais como síncrotrons, tem sido possível a resolução de estruturas de macromoléculas biológicas cujos cristais apresentavam dimensões menores que 0,1mm.

A estrutura cristalográfica de uma macromolécula pode ser obtida através da análise do padrão de difração produzida por seus cristais. Essa análise constituída de basicamente quatro passos: purificação e cristalização (1); coleta e processamento de dados (2); determinação da estrutura (3) e refinamento (4).

Figura 1 – Passos para a obtenção da estrutura de uma macromolécula.

2. Purificação e cristalização de macromoléculas

Devido ao fato que as macromoléculas são extraídas de complexas misturas biológicas, tais como as células, a purificação é um passo importante para a cristalogênesis. Como regra geral, pode-se dizer que, a baixa pureza da macromolécula biológica é a causa mais comum da falta de sucesso na cristalização da mesma.

A cristalização é a parte mais difícil quando queremos determinar a estrutura de uma macromolécula. A formação de um monocristal de tamanho e qualidade adequados para os experimentos depende de parâmetros como pH, temperatura, agente precipitante, solubilidade, entre outros. Devido ao fato que proteínas e ácidos nucléicos necessitam pH e força iônica definidas para a sua estabilidade e função, cristais de macromoléculas biológicas têm de ser crescidos a partir de soluções aquosas complexas. A cristalização começa com a fase de nucleação (formação dos primeiros agregados ordenados) que é seguida pela fase de crescimento. A nucleação requer um estado de supersaturação maior do que aquele da fase de crescimento. A cessação de crescimento de uma macromolécula pode ter diversas causas, desconsiderando as triviais, como remoção da macromolécula do meio de cristalização, temos causas tais como, defeitos de crescimento, envenenamento das faces, ou envelhecimento da macromolécula.

A principal diferença entre crescimento de cristais de pequenas moléculas e cristais de macromoléculas é a flexibilidade conformacional e a versatilidade química dessas macromoléculas e, conseqüentemente, sua maior sensibilidade às condições externas.

2.1. Solubilidade de macromoléculas

Para crescer cristais de qualquer composto, as moléculas ou íons têm de ser trazidos a um estado de supersaturação, um estado que é termodinamicamente instável, no qual pode se desenvolver numa fase amorfa ou cristalina quando este retornar ao equilíbrio. Supersaturação pode ser alcançada pela evaporação lenta do solvente ou pela variação de alguns dos parâmetros como temperatura, pH e força iônica. Conclui-se então que o conhecimento das solubilidades das macromoléculas é um pré-requisito para o controle das condições de cristalização.

O processo de cristalização de uma proteína, por exemplo, pode ser facilmente explicado através das observações em diagrama de fases (figura 2). Consideremos uma proteína dissolvida em um tampão. Nessa situação, para que a proteína seja levada a formar cristais, é necessário que as moléculas da proteína dissolvidas na solução, sejam trazidas a uma situação onde as moléculas estejam próximas umas das outras. Para levar a proteína a essa situação podemos aumentar sua concentração, ou aumentar a concentração do sal presente na solução da proteína de modo a trazê-la na região de supersaturação, de forma lenta. Na região de supersaturação teremos as moléculas da proteína próximas umas das outras, o que, em casos favoráveis, promoverá o aparecimento dos primeiros núcleos cristalinos. Esses microcristais servirão de base para o crescimento de cristais maiores, adequados para experimentos de difração de raios X.

Figura 2 – Diagrama de fases bidimensional de uma proteína.

Uma macromolécula biológica segue as mesmas leis da termodinâmica, como qualquer outro tipo de molécula (inorgânica ou orgânica) no que se refere à supersaturação, nucleação, e crescimento de cristais. Todavia, macromoléculas biológicas apresentam peculiaridades, porque as interações necessárias para solubilizá-las num solvente são similares, e podem ser competitivas com as interações intermoleculares que são responsáveis pela estrutura tridimensional das macromoléculas.

No caso de macromoléculas biológicas, a solubilidade é definida também pelas características do solvente. Como o solvente consiste usualmente de água a qual foram adicionadas diversas substâncias químicas para levar a solução até um dado pH (tampão), força iônica (sais), e eventualmente outros aditivos, estes compostos podem afetar a solubilidade da macromolécula biológica diretamente (pela interação com diferentes grupos funcionais da macromolécula e‚ eventualmente‚ modificando a conformação da macromolécula) ou indiretamente (através da modificação das propriedades físico-químicas do solvente).

2.2. Salting-in e salting-out

O aumento da solubilidade de uma macromolécula biológica a baixa concentração salina (<0,5M) é chamada salting-in. Este fenômeno é explicado pelas interações eletrostáticas não específicas entre a macromolécula carregada e as espécies iônicas do sal. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar este fenômeno é considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons de solvente a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução eles blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.

Outra forma de precipitar uma macromolécula é pela adição de sal (salting-out), este serve para imobilizar as moléculas de água, desta forma aumentando a concentração efetiva da macromolécula, ou seja, diminuindo a sua solubilidade. No fenômeno de salting-out a solubilidade da macromolécula é governada principalmente por efeitos hidrofóbicos.

2.3. Alguns métodos de cristalização de macromoléculas

  • Técnicas por partidas (adição de materiais):

Consiste em depositar uma microgota da solução de proteína ,por exemplo, (5-10 µl) numa pequena cavidade por baixo de uma solução de um óleo não volátil que protege a gota da perda de solvente por evaporação. A técnica por micropartidas é muito simples e pode ser usada em pelo menos duas modalidades: 1 Dissolve-se a máxima quantidade da proteína num pequeno volume da solução, que se encontra numa pequena placa, na presença dos agentes precipitantes. Coloca-se uma tampa sobre essa placa para proteger a solução da proteína e para impedir a evaporação rápida do solvente. Ao fim de algum tempo, e se as condições foram apropriadas, começarão a aparecer cristais da proteína, o que pode ser causado por se terem criado condições de sobressaturação, devido à evaporação lenta do solvente ou ainda por ligeiras alterações da temperatura que provocam a nucleação seguida de crescimento dos cristais. Dissolve-se a proteína numa solução adequada e adiciona-se o agente precipitante gradual e lentamente até que a mistura comece a ficar ligeiramente turva, menos transparente. Então o recipiente com esta solução é coberto para proteger da contaminação com bactérias e/ou outros contaminantes e colocado num local calmo de modo a permitir o crescimento dos cristais sem perturbações.

  • Diálise (troca de íons e líquidos)

Este método baseia-se na permeabilidade de certas membranas à moléculas pequenas, e em contrapartida na impermeabilidade dessas membranas a moléculas grandes como as proteínas. Esta técnica passou a ser usada na cristalização de proteínas após ter-se descoberto que a cristalização de certas proteínas poderia ser induzida pela adição ou remoção de íons à sua solução. Estes podem provir de um agente precipitante que ao associarem-se às moléculas da proteína provocam alterações na sua solubilidade. Os íons podem ser dializados para dentro ou para fora da solução da proteína, diminuindo assim a solubilidade e provocando a cristalização.

  • Equilíbrio de vapor

Esta técnica depende da troca de vapor entre a solução que contém a proteína e outra solução até que a primeira atinge condições de sobressaturação obrigando a proteína a separar-se da solução em que está dissolvida. Normalmente, é vapor de água, mas nalgumas situações usam-se outros solventes ou reagentes voláteis como compostos cujo vapor é trocado entre as duas soluções de modo a provocar a cristalização. A microtécnica de cristalização por troca de vapor utiliza volumes muito pequenos, 2-20 µl da solução de proteína, contendo também uma pequena quantidade de um agente precipitante não volátil e 1-2 ml da outra solução que contem uma maior concentração do agente precipitante não volátil. O objectivo é obrigar a proteína a cristalizar na gota. A técnica de troca de vapor é realizada numa caixa selada de modo a permitir que se atinja o equilíbrio entre a gota e o maior volume da solução, que é colocado num reservatório envolvendo a gota. O volume da solução no reservatório é tipícamente 1000 vezes maior que o volume da gota, de modo a que, no equilíbrio, a concentração do agente precipitante na gota é muito próxima da sua concentração na solução do reservatório.

  • Difusão de líquido (mistura de soluções)

Esta técnica foi também inicialmente desenvolvida por químicos na preparação de cristais de compostos orgânicos. Baseia-se no fato de que um composto pode ser muito solúvel num solvente mas insolúvel noutro. De um modo geral esta técnica depende da miscibilidade desses dois solventes, embora nem sempre tal seja necessário. A solução com o composto dissolvido é colocada num tubo de ensaio e depois, conforme a densidade do "não solvente", este é delicadamente colocado sobre, ou por baixo, da solução que contém o composto dissolvido. À medida que as duas soluções se misturam, reduzindo a solubilidade do composto em estudo, este se separará da solução, esperando-se que apareça sob a forma cristalina. A obtenção ou não de cristais depende do engenho do químico na escolha apropriada dos dois solventes cuja combinação leva à cristalização. No caso do bioquímico ou cristalógrafo, a solução do "não solvente" contém frequentemente um agente precipitante em concentração elevada.

3. Coleta e processamento de dados

A coleta e o processamento dos dados é o próximo passo no objetivo de se obter a estrutura. O sucesso desta etapa depende da qualidade dos cristais e da fonte de radiação utilizados.

Nesta etapa os cristais são caracterizados, ou seja, seus parâmetros de rede e suas simetrias são determinados. O conhecimento das amplitudes e das fases permitem a reconstituição da densidade eletrônica do cristal. Quando os raios X incidem sobre um cristal o mesmo gera feixes difratados, esta radiação difratada é resultado da interação dos campos elétricos dos raios X com a nuvem eletrônica dos átomos no cristal. Assim podemos afirmar que a interpretação do padrão de difração de raios X fornece informação sobre a parte eletrônica do cristal, mas especificamente sobre a densidade eletrônica do cristal. Tal grandeza física, indicada por ρ(xyz) e cujas unidades são e/Å3, pode ser usada para localizar a posição dos átomos na cela unitária. Seu cálculo é expresso pela equação abaixo:

Figura 3 – Equação para obtenção da densidade eletrônica do cristal

As amplitudes dos fatores de estrutura podem ser deduzidas das intensidades medidas, enquanto as fases não podem ser obtidas do padrão de difração, pois a informação sobre a fase de cada reflexão é perdida no processo de registro da informação; o que constitui um problema central da cristalografia, o “Problema das Fases”.

A quantidade de moléculas na cela unitária pode ser estimada através do cálculo da porcentagem do solvente e da simetria, assim, as intensidades medidas no padrão de difração são associadas aos diferentes planos do cristal, indicados pelos índices de Miller, o vetor (h K l).

Cristais de macromoléculas são bastante sensíveis aos raios-X. Muitas vezes é necessário utilizar vários cristais para se obter um conjunto de dados que seja necessário para prosseguir com os próximos passos. A coleta deve ser feita com o cristal resfriado instantaneamente num fluxo de nitrogênio gasoso a aproximadamente 100 K (criocristalografia). Isto permite a redução dos efeitos danosos da radiação direta e aumenta o tempo de vida do cristal. Dessa forma tem-se um melhor aproveitamento do material, pois apenas um único cristal pode fornecer dados suficientes para a resolução da estrutura e não é preciso realizar a integração com dados de cristais diferentes. Assim, cada conjunto de imagens geradas de um cristal forma um conjunto de dados a ser analisado. É possível realizar várias coletas e escolher o melhor conjunto de dados. Além disso, os dados coletados a frio apresentam melhor qualidade, pois o resfriamento mantém o nível de organização interna do cristal, necessária para uma boa coleta de dados, preservação da rede cristalina, informação expressa nos resultados pela mosaicidade. A distância do detector ao cristal deve ser regulada de forma a chegar o mais próximo possível da melhor resolução, limitada pela qualidade do cristal.

De posse das primeiras imagens é possível realizar a indexação e determinar o grupo espacial, as dimensões e orientação da célula unitária, e estimar a mosaicidade. A partir da medida da distância e dos eixos da rede recíproca do padrão de difração é possível determinar o tamanho e os eixos do cristal no espaço real. Esse passo é necessário para planejar uma estratégia de coleta de dados eficiente, minimizando o tempo e maximizando os resultados. Na indexação ocorre a identificação dos pontos e a determinação do índice de Miller de cada ponto.

O método de oscilação é utilizado para a coleta, sendo o cristal rotacionado a cada 1° com o objetivo de coletar o máximo de reflexões possíveis, visando propiciar uma maior coleta de dados. A completeza expressa nos dados após a indexação e integração dos dados, representa a porcentagem do número de reflexões observadas em relação ao número de reflexões possíveis para uma determinada resolução, que está limitada pela qualidade do cristal. Uma completeza de 100% é o resultado desejável, com a maioria das reflexões medidas várias vezes.

No processo de integração é quantificada a intensidade do ponto, retirando-se a contribuição proveniente da difração do solvente. Cada imagem em um mesmo conjunto de dados tem intensidade gravada sem uma escala diferente umas das outras, por diversos motivos como a variação na radiação incidente, absorção dos raios difratados ou destruição do cristal. Portanto, é necessário colocar todos os pontos em uma mesma escala. Após esse passo pode ser realizada a fusão dos dados: Os pontos com o mesmo índice de Miller são somados. Os pontos que foram agrupados como reflexões equivalentes simétricas de diferentes imagens terão suas intensidades somadas. Após esse processo, foram obtidos parâmetros para determinar a qualidade do cristal, representado pelos parâmetros da rede cristalina.

4. Determinação da estrutura

Partimos então para a determinação da estrutura tendo como informação um conjunto de dados do tipo (h K l) – índices de Miller, I – intensidade e σI – uma estimativa da qualidade da medida da intensidade estimada pelo valor da radiação de fundo ao redor do pico que esta sendo integrado.

Os métodos utilizados para a resolução de estrutura de moléculas pequenas, como métodos diretos que envolvem relações estatísticas entre os fatores de estrutura e o método de Patterson, não podem ser utilizados na determinação da estrutura de proteínas, pois esses métodos podem ser empregados para resolver estruturas de no máximo 100 átomos e uma proteína que é considerada pequena possui na ordem de 1000 átomos.

Existem basicamente três métodos utilizados na resolução da estrutura ou para solucionar o problema das fases no caso das proteínas.

4.1. Método da substituição molecular

Esse método é baseado no princípio que macromoléculas apresentam alta homologia seqüencial, tendendo a se enovelar de forma bastante similar, e desta forma, uma proteína cuja estrutura já tenha sido determinada serve como um modelo inicial para a obtenção de um conjunto preliminar de fases que pode ser subsequentemente refinado. O sucesso deste método está no fato de que hoje em dia existe um grande número de macromoléculas que já tem sua estrutura conhecida.

4.2. Método da substituição isomórfica

Depende da obtenção de cristais de derivados isomorfos (com átomos pesados que tenha maior contribuição para o espalhamento). Um derivado isomorfo perfeito é aquele em que uma única variação no mapa de densidade eletrônica, se deve à posição dos átomos pesados. A introdução desses átomos deve ser feita de modo a não afetar a estrutura da macromolécula original.

4.3 Método de dispersão anômala a múltiplos comprimentos de onda

Quando os elétrons se encontram em camadas mais próximas do núcleo o tratamento de dados devido ao espalhamento desses elétrons deve ser cuidadoso, uma vez que a força de interação entre esses elétrons e o núcleo não podem mais ser desprezadas e o elétron não pode mais ser tratado como livre. Devido à força de interação com o núcleo, existe a introdução de um termo imaginário ao fator de espalhamento atômico que depende do comprimento de onda da radiação.

5. Refinamento da estrutura

Refinamento é o processo de encontrar uma melhor concordância entre o modelo proposto para a estrutura da molécula e a sua estrutura real. Esta concordância deve refletir numa igualdade entre os fatores de estrutura calculados (Fcalc) e os fatores de estrutura observados (Fobs). O acompanhamento da qualidade deste processo é feito por meio do cálculo do fator R (Rfator) durante o processo. Para estruturas cristalográficas de proteínas resolvidas à resolução melhor de 2,0 Å, espera-se que o R atinja valores menores que 20%. Como R pode ser minimizado artificialmente e levando em consideração a redundância dos dados de raios X, uma pequena porcentagem das reflexões são excluídas do refinamento e utilizadas como um conjunto de teste no cálculo de um novo fator R chamado Rlivre, que é isento de minimização artificial. Normalmente o Rlivre possui um valor um pouco mais alto que o R, normalmente não excedendo os 10% para estruturas refinadas a alta resolução.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Júnior, W.F.A. Refinamento cristalográfico de biomoléculas. São José do Rio Preto, 2004

Nonato, M.C. Estudos cristalográficos em macromoléculas biológicas: Aplicações em Calgranulita C de Glanulócitos porcinos. Tripanotiona redutase de Trypanosoma cruzi e Fosfolipase A2 Extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni. São Carlos, 1997.

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