crescimento de Gx e a produção de CB Revista de tecnolgia

crescimento de Gx e a produção de CB Revista de tecnolgia

(Parte 1 de 3)

Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR

Campus Ponta Grossa - Paraná - Brasil ISSN: 1981-3686 / v. 02, n. 01: p. 95-103, 2008

Revista Brasileira deTecnologia

Agroindustrial

CRESCIMENTO DO Acetobacter xylinum (ATCC 23769) E A PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA

GROWTH OF Acetobacter xylinum (ATCC 23769) AND THE BACTERIA CELLULOSE PRODUCTION

Denise Milleo Almeida1, 3 ; Gilvan Wosiacki1,2; Guataçara dos Santos Junior3; Elisângela Serenato Madalozzo2; Misaeli Maria Zanlorenzi3

1 Universidade Federal do Paraná – UFPR – Curitiba – Brasil 2 Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG – Ponta Grossa – Brasil 3Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR – Ponta Grossa – Brasil misaelizanlorenzi@hotmail.com

Resumo Esta pesquisa teve como objetivo verificar o crescimento da biomassa da Acetobacter xylinum (ATCC 23769) com a produção de celulose bacteriana. O cultivo ocorreu em água de coco maduro (200 ml) na forma estática e em agitação (100 rpm) e com adição de diferentes soluções salinas

(NH4PO4, KH2PO4, MgSO4 7H2O, Na2HPO4, FeSO4, H3BO3), configurando 32 ensaios. Foram adicionados 5% (v/v) ou 0,06g de biomassa seca do inóculo com incubação a 30ºC±2ºC /24h, 96h e

168h. Para a remoção da biomassa o caldo de fermentação foi centrifugado a 7000 rpm/15 min a 4ºC, seguida de lavagem com água destilada e posteriormente levada à desidratação em estufa a 50ºC±5ºC/24h até massa constante. Ao sobrenadante foi adicionada a proporção de solvente etanol 96ºGL+acetona P.A. (1:1:2) para precipitação da celulose. Após 24h de refrigeração procedeu-se nova centrifugação por 30 min para a recuperação da celulose. O precipitado foi lavado com água destilada e desidratado em estufa a 50ºC±5ºC/24h até massa constante. A maior produção de biomassa ocorreu em cultivo estático entre 96 e 168 horas. Já para a produção de celulose, não se pode afirmar que exista maior rendimento entre o cultivo estático ou agitação. O microrganismo produz uma quantidade elevada de celulose nas primeiras 96 horas de fermentação seguida de um maior aumento na produção de biomassa.

Palavras-chave: biomassa, celulose, Acetobacter xylinum.

1. Introdução

Devido aos avanços da biotecnologia, vários estudos vêm sendo desenvolvidos para produção de polímero de origem microbiana, também chamados de biopolímeros (AQUINO, 2006). São também conhecidos como gomas ou exopolissacarídeos, que tem a capacidade de formar géis e soluções viscosas em meio aquoso (MOREIRA et al., 2003).

Entre os biopolímeros de grande interesse está a celulose produzida pela linhagem de Acetobacter xylinum. Suas aplicações na indústria de alimentos são: sobremesa (nata de coco,

Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial sorvetes com baixa caloria, lanches, doces); espessantes (sorvetes e temperos para saladas); bases para redução de peso; bases para alimentos artificiais; tripas para embutidos; soro para redução de colesterol (US patente 4, 960,763); elixir Kombucha ou chá Manchurian (BROWN apud SILVA, 2003).

Porém, as pesquisas acadêmicas, apresentam um rendimento baixo quanto ao volume de fibras de celulose (nata) produzida. Desta forma, há necessidade de novos estudos e experimentos na cinética do processo fermentativo buscando maior eficiência entre o crescimento do microrganismo, a formação do biopolímero.

Desta forma, a pesquisa teve como objetivo verificar o crescimento da biomassa da Acetobacter xylinum (ATCC 23769) com a produção de celulose bacteriana.

2. Materiais e métodos

O microrganismo utilizado no processo de fermentação foi o Acetobacter xylinum (ATCC 23769). O cultivo ocorreu em água de coco maduro (200 ml) na forma estática e em agitação (100 rpm) e com adição de diferentes soluções salinas (NH4PO4, KH2PO4, MgSO4 7H2O, Na2HPO4,

FeSO4, H3BO3), configurando 32 ensaios. Foram adicionados 5% (v/v) ou 0,06g de biomassa seca do inóculo com incubação a 30ºC±2ºC /24h, 96h e 168h. O pH inicial do meio de cultivo foi ajustado para 5,0.

Para recuperação da biomassa e da celulose bacteriana adaptou-se procedimento descrito por

ROTTAVA (2005), FORNARI (2006), BERWANGER (2005), LEE JIN (2001) no qual o caldo de fermentação foi centrifugado a 7000 rpm/15 min a 4ºC para remoção da biomassa seguida de lavagem com água destilada e posteriormente levada à desidratação em estufa a 50ºC±5ºC/24h até massa constante. Ao sobrenadante foi adicionada a proporção de solvente etanol 96ºGL + acetona P.A. (1:1:2) para precipitação da celulose. Após 24h de refrigeração procedeu-se nova centrifugação por 30 min para a recuperação da celulose. O precipitado foi lavado com água destilada e desidratado em estufa a 50ºC±5ºC/24h até massa constante.

aproximadamente normal

Neste trabalho houve a necessidade de se obter a estimativa da média populacional, bem com sua margem de erro e estimativa de um intervalo de confiança para o rendimento médio de biomassa seca e para o rendimento médio de celulose produzido. Salienta-se que tais conceitos foram utilizados considerando pequenas amostras. Portanto, para as inferências realizadas foi suposto que a distribuições das populações das variáveis analisadas se apresentam em distribuição Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial

Para obter a margem de erro e o intervalo de confiança da média populacional para as diversas variáveis analisadas, utilizaram-se respectivamente as equações (1) e (2) conforme TRIOLA (1990, p. 153) e foi utilizado nível de significância igual a 5%.

stE2/α=,(1)

Onde é o valor crítico obtido da distribuição t de Student e tem n-1 graus de liberdade.

Ainda a equação (1), s indica o desvio-padrão amostral e n o tamanho da amostra utilizada. O intervalo de confiança é obtido como segue:

_+<µ<−,(2)

ExEx onde é a média aritmética amostral, E é a margem de erro obtida pela equação (1) e _xµ é a estimativa da média populacional.

Também houve a necessidade do uso nesse trabalho do diagramas em caixa (boxplot) com a expectativa de revelar tendências centrais, a variabilidade dos dados e a presença de outliers (valores extremos). Para se obter os diagramas em caixa necessitam-se do primeiro quartil, terceiro quartil e mediana. Maiores detalhes sobre os diagramas em caixa podem ser obtidos em TRIOLA (1990, p.52).

3. Resultados e discussão

A produção de biomassa e celulose aumentou à medida que o tempo de fermentação foi se desenvolvendo. Comparando a quantidade de biomassa, durante o processo de fermentação, em cultivo estático e em agitação a 24h, 96h e 168h pode-se observar uma maior produção em cultivo estático. Entretanto, a melhor produção de celulose de 17,1g/200mL ocorreu quando a quantidade de biomassa chegou a 0,59g/mL e 0,45g/200mL em cultivo de agitação.

Considerando ambas as formas de cultivo, estática e agitação, a maior produção de biomassa ocorreu entre 96h e 168h com volume médio de rendimento de 0,14g/200mL. Porém, o maior rendimento na produção de celulose ocorreu entre 24h e 96h com volume médio de 1,83g/200mL do fermentado.

A média da velocidade de formação da biomassa foi de 0,003g.h-1 e da celulose foi de 0,07 g.h-1. O rendimento médio, do processo de fermentação, da produção de biomassa em relação à formação da celulose foi de 0,042g. A tabela 1 apresenta a produção de biomassa e celulose em diferentes tempos de cultivo.

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Tabela 1 – Produção de biomassa e celulose em diferentes tempos de cultivo 24h 96h 168h

Ensaios Biomassa seca g/200mL Celulose g/200mL

Biomassa seca g/200mL Celulose g/200mL

Biomassa seca g/200mL Celulose g/200mL

*Ensaios cultivados na forma estática.

Os gráficos, boxplot, de diagramas em caixa mostram a variabilidade dos dados, bem como possíveis outliers (valores extremos) existentes nos conjuntos de dados. Nesses pode-se ter uma visão geral do comportamento dos dados considerando o Q1 (primeiro quartil), a mediana, o Q3 (terceiro quartil) e a posição do valor médio comparados com essas três medidas. A seguir, a figura1 ilustra os diagramas em caixa dos dados referente ao rendimento da biomassa considerando os cultivos estático e agitação, nos tempos 24h, 96h e 168h.

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Figura 1 – Boxplot do cultivo estático e cultivo em agitação da biomassa seca em g/200 mL

Biomassa seca 168h - dinâmico

Biomassa seca 96h - dinâmico

Biomassa seca 24h - dinâmico Biomassa seca 168h - estático

Biomassa seca 96h - estático Biomassa seca 24h - estático

É imediata a observação que os valores médios estimados considerando o cultivo estático são maiores nos respectivos tempos de cultivo considerados. Porém, a variação destes dados entre si é maior quando comparada como a variação dos dados considerando o cultivo em agitação.

Na figura 1 observa-se a existência de dois outliers, ambos para o rendimento de biomassa seca considerando tempo 96 h, mas um em cultivo estático e outro em cultivo de agitação. Esses dois casos tratam-se, respectivamente, dos valores 0,86 g/200 mL (amostra 10) e 0,61 g/200 mL (amostra 21), o qual merece uma atenção especial, pois são apenas esses dois que se apresentam acima dos demais dados de forma significativa. Pode-se nesses dois casos verificar o que influenciou um rendimento significativamente maior quando comparados com as demais amostras. Por exemplo, tal influência pode ter sido motivada pela composição do meio de cultivo.

Nesse trabalho não foi possível tal investigação. Este fato será melhor detalhado em trabalhos futuros. Nos demais tempos não houve nenhum outliers detectado. Logo, tem-se que nenhum valor se destaca dos demais quanto sua magnitude.

A figura 2 ilustra os diagramas em caixa (boxplot) dos dados referentes ao rendimento da celulose considerando o cultivo estático e agitação, nos tempos 24h, 96h e 168h.

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