Métodos Imunológicos

Métodos Imunológicos

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Métodos Imunológicos

Guido Lenz

Biofísica, 2004 1. Introdução

Ter como função proteger um organismo de qualquer componente externo num mundo de miriades de componentes internos e de uma imensidão de prováveis invasores fez do sistema imunológico, ao longo da evolução, um dos sistemas biológicos mais complexas.

Pela sua importância vital e talvez pela sua transparente complexidade, o sistema imunológico sempre produziu um grande fascínio sobre os cientistas, fascínio este comparável ao dedicado ao sistema nervoso, talvez por suas semelhanças no que se refere à memória, comunicação e inteligência (para usar os termos cunhados para este, mas certamente úteis naquele).

O conhecimento adquirido sobre o sistema imunológico, principalmente sobre a produção de anticorpos, conduziu a uma revolução nas técnicas usadas nas ciências biológicas. Atualmente uma grande parte dos métodos bioquímicos e histológicos lança mão desta poderosa ferramenta chamada anticorpo para alcançar os seus objetivos. Acredito que os métodos imunológicos, ao lado da biologia molecular, estão entre os maiores avanços em termos metodológicos conseguidos nos últimos 10 ou 20 anos.

Duas afirmações podem ser citadas para argumentar porque os métodos imunológicos são um conhecimento imprescindível na formação de estudantes das áreas biológicas: 1. o envolvimento direto com estes métodos, para estudantes que irão usá-los em trabalhos experimentais e 2. melhor compreensão de assuntos que usam estes métodos, que são largamente encontrados em todas os ramos das ciências biológicas.

Estes argumentos, aliás, valem para o estudo dos métodos como um todo, pois, para que se possa analisar de forma crítica um texto científico, é necessário ter conhecimento dos métodos usados para produzir os resultados, sem o qual a análise se torna no mínimo superficial.

2. Anticorpos

Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta afinidade. Discutiremos a seguir como estas proteínas são produzidas nos organismos pelos linfócitos e como isto pode ser manipulado para fins específicos.

2.1 Produção

em disciplinas específicas)

A descoberta dos mecanismos de produção de anticorpos é, sem sombra de dúvida, uma das grandes vitórias das ciências biológicas neste século, devido a sua complexidade, mas principalmente pelos benefícios que representa para a humanidade. Discutiremos apenas superficialmente os mecanismos que levam à geração de anticorpos, pois a complexidade deste assunto não permite a sua análise aprofundada neste texto (certamente isto será feito

Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B, que se originam na medula, sendo distribuídos pelo organismo inteiro através do sistema linfático. A quantidade de linfócitos no corpo humano é estimado em cerca de dois trilhões (2 x 1012), sendo esta quantidade elevada fundamental para o perfeito funcionamento do sistema imunológico, como veremos a seguir. O funcionamento do sistema imunológico, e conseqüentemente da produção de anticorpos é explicada pela teoria de seleção clonal. Esta teoria afirma que no embrião sejam produzidos, por recombinação genética,1 uma imensa variedade de linfócitos cada qual contendo um receptor diferente 2. No período embrionário, os receptores dos linfócitos que reagirem com algum antígeno serão eliminados, fazendo com que os linfócitos que respondem a componentes do próprio organismo morram. Se neste período estiverem presentes antígenos externos, não se desenvolverá nenhuma imunidade contra este antígeno. Por outro lado, se algum antígeno do organismo não puder ser “encontrado”, futuramente este antígeno será interpretado como estranho e se desenvolverá uma reação autoimune.

Quando um antígeno ingressa em um organismo adulto, o(s) linfócito(s) que tiver(em) o receptor para este antígeno se reproduzem, e se diferenciam, voltando toda a sua atividade para a síntese de anticorpos (o mesmo anticorpo que eles possuem como receptor - ou seja, aquele que reage com o antígeno). Desta forma, um certo período após o antígeno ter entrado em contato com o organismo, inicia-se um grande produção de anticorpos, que poderá então precipitar o antígeno, tirando-o de circulação (Figura 1).

1 acredita-se que genes altamente variáveis possam se recombinar de inúmeras formas para produzir uma variedade extremamente grande de anticorpos. 2 este receptor na realidade é um anticorpo produzido somente por este linfócito que pode se comunicar com o interior, sinalizando tanto a morte (no embrião) como a proliferação (no adulto)

É necessário destacar que o sistema imunológico produz uma diversidade tão grande de anticorpos que ligará em virtualmente tudo e depois seleciona o que é próprio e o que é estranho, o que significa que os linfócitos são selecionados e não moldam o anticorpo de acordo com o antígeno3.

Linfócitos imaturos quando ativados pelo antígeno se diferenciam em linfócitos maduros, produtores de anticorpos e também linfócitos de memória, que, numa segunda exposição ao antígeno, se ativam muito mais rapidamente do que as células virgens fazendo com que a segunda resposta imunológica seja muito mais intensa e rápida do que a primeira.

Um certo antígeno pode ser reconhecido por vários linfócitos, levando a ativação de vários clones de linfócitos B. Cada qual destes clones reconhece uma parte diferente ou se liga de uma forma diferente ao antígeno, através de uma parte do antígeno denominada epitopo, que é a parte do antígeno efetivamente reconhecida pelo anticorpo para que a interação antígeno-anticorpo possa ocorrer. Até antígenos pequenos como a grupo dinitrofenil podem ser reconhecidos por vários linfócitos, ou seja, possuem vários epitopos. Desta forma,

3 embora o anticorpo, após a seleção do linfócito B que o produz, pode ser alterado afim de produzir um aumento na sua afinidade, o que parece ser um forma de moldagem antígeno específica.

Figura 1. Produção de anticorpos pelos linfócitos B.

um antígeno grande, como uma proteína, pode possuir inúmeros epitopos, cada qual induzindo a produção de um anticorpo específico.

Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epitopos do antígeno (por exemplo, várias partes de uma proteína).

Este tipo de anticorpo provém de somente um linfócito B, selecionado artificialmente e replicado diversas vezes como um clone. Desta forma, este anticorpo liga somente a um epitopo de uma única forma.

O primeiro passo para a produção de um anticorpo é a purificação do antígeno. Isto pode ser realizado de diversas formas, usando técnicas de purificação como cromatografia e eletroforese. Com o desenvolvimento e o barateamento da síntese de peptídeos, muitos anticorpos são produzidos usando-se peptídeos de 10 a 14 aminoácidos acoplados a uma proteína carreadora.

A imunização é realizada aplicando-se no animal (coelho, camundongo, cabra etc.) o antígeno juntamente com conjunto de substâncias que ativam o sistema imunológico, denominados de coadjuvantes, como por exemplo o coadjuvante de Freud. Após alguns dias, o sangue do animal é recolhido e, através de centrifugação, é separado o plasma sanguíneo (soro), na qual se encontram os anticorpos.

Algumas vezes é possível utilizar o soro, pois a grande maioria de anticorpos ali presentes são os anticorpos sintetizados contra o antígeno injetado, mas geralmente é importante separar a fração das imunoglobulinas ou de preferência do anticorpos específico. Isto geralmente é realizado com cromatografia por afinidade, na qual se usa a a proteína A (ver Pontes item 2.3.1) ou o próprio antígeno como fase estacionária numa coluna de afinidade, sendo que o anticorpo purificado é liberado da coluna através do uso de uma solução com pH 2,5.

A Figura 2 mostra um esquema da produção de anticorpos monoclonais. Após imunizar o animal (como descrito no item anterior), retira-se linfócitos do baço e funde-se estas células com mielomas (ver legenda da Figura 2) o que produz hibridomas imortalizados. Após selecionar as células com um meio de cultura que permite o crescimento somente de hibridomas, estas são colocadas em placas de cultura a uma densidade de uma célula por poço, fazendo com que as células de cada poço sejam descendentes de somente uma célula de hibridoma, ou seja, um clone. Estes hibridomas iniciarão a produção de anticorpos, que estarão presentes no meio de cultura. O(s) clone(s) que produzirem os anticorpos com maior afinidade e mais específicos podem ser selecionados através de testes usando técnicas imunológicas como a imunodetecção.

Uma descoberta crucial para a produção de anticorpos monoclonais foi a imortalização dos linfócitos, fazendo com que, uma vez feito este processo, se possa produzir anticorpos por um tempo indeterminado.

* 1. Injetar o rato com a proteína X; 2. Células de mieloma imortalizadas (tipo de cançer) e inaptas de crescer em um meio HAT (meio que contém certos inibidores que afetam somente estas células); 3. retirar alguns linfócitos do baço do rato, sendo que alguns destes produzirão o anticorpo desejado; 4. misturar e fundir as células e passar para um meio HAT; 5. células não fundidas morrerão pois não são imortalizadas (linfócitos) ou não resistem ao HAT; 6. hibridomas crescem e se multiplicam; 7. células únicas são cultivadas em poços individuais; 8. testar o sobrenadante de cada poço contra a proteína X.

2.2 Estrutura

Os anticorpos, coletivamente denominados imunoglobulinas (Ig), são formados por quatro subunidades ligadas entre si por quatro pontes dissulfeto, como mostra a Figura 3.

Camundongo Imunizado com antígeno X

Linfócitos do baço que produzem AC contra X são isolados.

Linfócitos são fundidos com mielomas (imortais)

Células híbridas são selecionadas (mieloma/linfócito)

Células são clonadas

AC é produzido no meio de cultura e este meio é testado.

Linhagem que produz o melhor AC é crescida e o AC é purificado. Por serem células imortais, isto pode ser realizado indefinidamente.

Figura 2. Produção de anticorpos monoclonais*

Estas quatro subunidades são constituídas de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L). A forma dos anticorpos se assemelha a de um “Y”, sendo que na parte de “cima” se encontram dois sítios idênticos de ligação ao antígeno, o que possibilita a ligação cruzada entre eles, podendo desta forma produzir uma malha antígeno/anticorpo, isto é, um precipitado.

Os anticorpos são classificados em IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, sendo que o IgG representa 75% das Ig totais e devido a isso é tão largamente utilizado nas técnicas envolvendo anticorpos.

O sítio de reconhecimento dos antígenos está localizado onde as partes variáveis de H e L se encontram, fazendo com que variações tanto de H como de L alterem este sítio, sendo que o responsável pela imensa variedade de anticorpos possíveis parece ser a combinação das variações destes dois sítios.

2.3 Conjugados

Como foi discutido acima, os anticorpos têm como principal característica a especificidade pelo antígeno. Para que estes possam ser usados na detecção de antígenos específicos num universo de milhares, é necessário que os anticorpos estejam conjugados, isto é, ligados, geralmente de forma covalente, a compostos que permitam a separação (esferas de agarose) ou a detecção (peroxidase, flouróforos, ouro). A seguir, analisaremos as características dos conjugados mais utilizados. No caso da agarose, geralmente usa-se o brometo de cianogênio (NCBr), que reage com os grupos OH da agarose formando a agarose ativada (contendo o grupo (-O-C(=NH2)-Br)). Este grupo reage com aminas primárias, como é o caso do aminoácido lisina. Pode ocorrer que esta forma de ligação não funcione adequadamente devido ao impedimento estérico (isto é, a lisina da proteína não consegue atingir a agarose ativada). Para contornar este problema, pode utilizar-se agarose ativada por grupos epoxi ligadas à agarose por espaçadores (por exemplo contendo 12 carbonos). Estes grupos epoxi podem ligar-se a vários grupos químicos como NH2, COOH, SH e OH, facilitando em muito a ligação da agarose ao anticorpo.

A modificação de anticorpos é um processo bastante trabalhoso. Devido a isso, geralmente usa-se vários anticorpos, sendo o primeiro (que reconhece o antígeno - ver Figura 7), sem nenhuma modificação, reconhecido por um segundo anticorpo, que nada mais é do

Figura 3. Estrutura geral dos anticorpos.

que um anticorpo contra a imunoglobulina do animal no qual foi produzido o primeiro anticorpo, sendo este anticorpo ligado a alguma molécula de detecção, como por exemplo a peroxidase ou moléculas fluorescentes.

Para que se possa separar um antígeno do restante de componentes de um homogeneizado, é necessário que o anticorpo específico para este antígeno esteja ligado a algo facilmente separável. Geralmente liga-se o anticorpo a esferas de agarose que é um material inerte e pode ser utilizado tanto em colunas cromatográficas como pode ser facilmente separado por centrifugação (como no caso da imunoprecipitação). A ponte entre as esferas de agarose e o anticorpo é geralmente feita pela proteína A, um polipeptídeo de 42 kDa, isolado do Stphylococcus aureus, que se liga fortemente à região Fc das imunoglobulinas de várias espécie. Esta propriedade é muito útil para separar imunoglobulinas, especialmente do tipo IgG, através de cromatografia de afinidade ou na imunoprecipitação.

Para a detecção do anticorpo são utilizados diversos métodos, escolhidos de acordo com a técnica.

A peroxidase é uma enzima que usa o H2O2 para oxidar os seus substratos. Estes substratos são desenhados de tal forma que a sua oxidação possa ser detectada pela liberação de luz (luminol), pela formação de uma precipitado colorido (DAB) ou então pela transformação de um composto incolor num composto colorido e que possa ser determinado quantitativamente por espectroscopia.

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