Mestrado: Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp

Mestrado: Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização...

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Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas

Tatiana Cristina Moço

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, do Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção de título depara obtenção de título de Mestre em Biologia Geral e Aplicada.

Botucatu -SP 2008

Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes e caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) naturalmente infectadas

Mestranda: Tatiana Cristina Moço Orientadora: Profa. Dra. Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, d It it t d Bi iê ido Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção de título de Mestre em Biologia Geral e Aplicada.

Botucatu -SP 2008

Aos meus pais e à minha avó Jandira (in memorian), pela confiança, apoio incondicional e carinho, dedico.

“Se vi mais longe, foi porque apoiei-me em ombros de gigantes...” (Newton)

Agradecimentos

À minha orientadora Lucia pela ajuda amizade e por acreditar que seria possívelÀ minha orientadora Lucia, pela ajuda, amizade e por acreditar que seria possível... À FAPESP, FUNDAP e à CAPES, pelo apoio financeiro... Ao professor Reinaldo, pela parceria, amizade e paciência... Aos professores Newton, Paulo e Teresa Cristina, por cederem seus respectivos laboratórios bl h d ldpara que esse trabalho pudesse ser concluído... À professora Luciene, pela paciência e ajuda nas análises estatísticas... À Karis e Adriano (Barnabé), pelos risos, amizade e imprescindível ajuda com a genética molecular... Aos amigos do Departamento de Parasitologia, em especial, Valdir, Márcia, Bicho, Salete, Nilza, Bruna, Aruaque, Giane, Betina, Jú, Karina, Zica, Denise e Satie, pela ajuda, amizade e muita diversão... Ao CEVAP, onde tudo começou, e aos amigos que lá conquistei, em especial, Mixa, Tidei, Thomaz, Bráz, Rui, Ana Silvia, Paulinho, Melissa, André, Fabiana, César, Lú, Marli, Rolão, Corvo, Guima e Meso, pelos anos de convivência, parceria, cumplicidade, amizade, carinho e muitas risadas... Ao casal Benedito e Silvia Barraviera, pela parceria e amizade... Aos amigos próximos, em especial, Coruja, Vaca, Rita,Vivi, Nice e Bucha, pelas risadas, amizade e paciência... Aos amigos distantes, mas não menos queridos, Luciana, Aninha, Marco, Ana Rita, Sagüi, Chris, Xixa, Fabrício, Bié, Éder, Polato, Mê, Neto, Everaldo , Gule e Léo, por continuaremG p a fazer parte da minha vida... Aos amigos da XXXIV, em especial ao “Grupo 6”, Xarlene, Pimpo, Koala e Macuco... À minha família, pelo apoio e paciência... Aos meus cães, em especial ao Bico, pelo amor incondicional...Aos meus cães, em especial ao Bico, pelo amor incondicional... Ao Gordo, por me “acolher” em tantos momentos e ter me poupado das naturais crises de estresse...

Sumário Sumário

Introdução Geral1
Ciclo de vida de Hepatozoon spp. em serpentes2
Vetores e hospedeiros intermediários de Hepatozoon spp2
Sintomatologia da infecção por Hepatozoon spp3
Critérios taxonômicos para identificação de Hepatozoon spp3
Freqüência de Hepatozoon spp. em serpentes4
Descrição de espécies de Hepatozoon spp. em algumas serpentes brasileiras5
Caracterização molecular de Hepatozoon spp. em serpentes7
Considerações finais9
Referências Bibliográficas10

Sumário

serpentes brasileiras recém capturadas17
Resumo18
Abstract19
Introdução20
Material e Métodos21
Resultados21
Discussão25
Referências Bibliográficas27

Artigo 1: Freqüência de infecção por Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) em

naturalmente infectadas28
Resumo29
Abstract30
Introdução31
Material e Métodos34
Resultados39
Discussão56
Referências Bibliográficas61

Artigo 2: Caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) Conclusões gerais....................................................................................................................67

Introdução Geral Introdução Geral

Introdução Geral

O termo hemogregarina é usado para descrever coletivamente parasitas sangüíneos pertencentes às subordens Adeleina e Eimeriina do Filo Apicomplexa (Levine et al., 1980). Os principais gêneros deste grupo são Hepatozoon (Hepatozoidae) e Haemogregarina (Hemogregarinidae).

As hemogregarinas são os mais comuns protozoários hemoparasitas de répteis

(Wosniak et al., 1994). A subordem Eimeriina inclui os gêneros Sckellackia e Lainsonia, que parasitam répteis, e Lankesterella, parasitas de anfíbios. Em Eimeriina, tanto a esporogonia como a merogonia ocorrem no hospedeiro vertebrado e o hospedeiro invertebrado atua apenas como vetor mecânico para a transmissão dos parasitas. Por outro lado, na subordem Adeleina, do qual fazem parte os gêneros Hepatozoon, Haemogregarina e Karyolysus, a esporogonia ocorre no vetor e a merogonia no hospedeiro vertebrado (Lane & Mader, 1996).

Historicamente, parasitas sangüíneos de anfíbios, serpentes, lagartos, crocodilianos, aves e mamíferos foram incluídos no gênero Haemogregarina, como resultado da similaridade morfológica de gamontes entre hemogregarinas de diferentes gêneros (Smith, 1996). Espécies de Haemogregarina não podem ser distinguidas de Hepatozoon spp. tendo como base somente a aparência de seus gamontes intraeritrocíticos e merontes hepáticos. A identificação genérica é também dependente da natureza do desenvolvimento esporogônico no vetor (Desser et al., 1995). Em Hepatozoon spp. a esquizogonia ocorre somente nos tecidos do hospedeiro vertebrado, enquanto que em Haemogregarina, além de ocorrer nos tecidos, a esquizogonia ocorre também no sangue periférico. Hepatozoon spp. têm sua esporogonia ocorrendo na hemocele do vetor e contêm oocistos com vários esporocistos, transmitidos aos vertebrados pela ingestão do invertebrado infectado. Para o gênero Haemogregarina, a esporogonia ocorre no estômago do vetor, seus oocistos não possuem esporocistos e sua transmissão é feita pela inoculação de esporozoítas via saliva (Desser, 1993).

Após vários estudos, os espécimes de hemogregarinas, encontrados em serpentes, foram identificados como pertencentes ao gênero Hepatozoon, com exceção da Haemogregarina pallida, de Thamnodynastes pallidus nattereri, que apesar de apresentar esporozoítas contidos em esporocistos, o que não era admitido para o gênero Haemogregarina (Mackerras, 1961; Ball, 1967), apresenta desenvolvimento esquizogônico tanto nos tecidos quanto no sangue periférico da serpente (Pessoa et al., 1971b).

Ciclo de vida

As hemogregarinas da subordem Adeleina têm ciclo heteroxênico, envolvendo um estágio merogônico (fase assexuada) no hospedeiro vertebrado e outro gametogônico e esporogônico (fase sexuada) no vetor invertebrado (Wosniak et al., 1994). Micro e macrogamontes são ingeridos pelo vetor hematófago juntamente com o sangue do hospedeiro vertebrado e migram para a sua parede intestinal, onde ocorre a gametogênese e posterior fecundação, originando um zigoto, que tem rápido crescimento, formando um oocisto, contendo muitos esporocistos com esporozoítas, que permanecem na hemocele do vetor. O hospedeiro vertebrado, no caso de Hepatozoon spp., adquire a infecção pela ingestão direta do vetor portador do oocisto, ou indiretamente, através da ingestão de outros hospedeiros intermediários vertebrados, como peixes e anfíbios, que tenham ingerido vetores hematófagos infectados. Os esporozoítas contidos nos esporocistos são liberados no intestino desse hospedeiro intermediário, podendo seguir para os hepatócitos, formando um cistozoíto. Após a ingestão do hospedeiro intermediário ou do esporocisto do vetor hematófago, ocorre a formação de esquizontes nos tecidos da serpente e posterior liberação de merozoítas na circulação, os quais, após invadirem as células sangüíneas, formam os gamontes infectivos para os vetores hematófagos (Smith, 1996).

Vetores e hospedeiros intermediários de Hepatozoon spp.

Os principais vetores invertebrados de Hepatozoon spp. são mosquitos (Culicidae), moscas (Diptera), mosquito-palha (Phlebotominae), moscas tse-tse (Muscidae), triatomíneos (Hemíptera), piolhos (Anoplura), pulgas (Siphonaptera), carrapatos (Ixodidae e Argasidae) e ácaros (Acari) (Smith, 1996). Há relatos não confirmados de sanguessugas atuando como vetores destes parasitas (Pessoa & Cavalheiro, 1969 a,b; Smith, 1996).

Espécies do gênero Hepatozoon podem ser encontradas parasitando aves, mamíferos, anfíbios e répteis, dentre os últimos, lagartos, crocodilianos, tartarugas e serpentes (Smith, 1996). Em serpentes terrestres ocorrem, principalmente, espécies do gênero Hepatozoon, enquanto que em répteis aquáticos predominam as do gênero Haemogregarina e em lagartos do velho mundo e serpentes arborícolas, as do gênero Karyolysus (Campbell, 1996).

Até 1996 eram conhecidas 121 espécies de Hepatozoon parasitas de serpentes, 46 espécies parasitas de mamíferos e 42 de anfíbios (Smith, 1996). Após 1996, pelo menos mais 12 novas espécies de Hepatozoon foram descritas infectando serpentes (Telford Jr et al., 2001, 2002, 2005 a,b, Sloboda et al., 2007).

Sintomatologia da infecção por Hepatozoon spp.

Hepatozoon spp. de répteis são, aparentemente, bem adaptados, causando pouca ou nenhuma patologia nos seus hospedeiros naturais. Em um hospedeiro não natural, as infecções podem causar doenças inflamatórias clinicamente significativas, entre elas, hepatite necrotizante, pancreatite e esplenite (Pessoa et al., 1974; Wosniak & Telford Jr, 1991). Merontes também foram encontrados no cérebro de um exemplar de Crotalus durissus terrificus que apresentou problemas neurológicos em cativeiro (Wosniak et al., 1996). Campbell (1996) também relatou que em infecções com alta parasitemia pode-se observar um quadro de anemia hemolítica. Madsen et al. (2005) relataram que o parasitismo por Hepatozoon sp. provocou uma significativa redução no crescimento de Liasis fuscus na natureza. Além disso, os autores observaram que os parasitas diminuíram o rendimento reprodutivo das fêmeas infectadas. Estes estudos demonstram que o impacto do parasitismo por Hepatozoon spp. em serpentes pode não ser observado por meio de doença aparente, mas pode ser muito importante na ecologia das espécies.

O fato de seu potencial patogênico quando em hospedeiros não naturais e as proporções significativas que essa parasitose pode ganhar em condições de cativeiro, quando não há um rígido controle parasitológico, justifica a necessidade de um bom diagnóstico para evitar a disseminação da doença dentro do criadouro. Geralmente, o diagnóstico é feito pela análise do sangue periférico corado por Leishman ou Giemsa (Campbell, 1996; Moço et al., 2002; O’Dwyer et al., 2003a,b). Atualmente, diagnósticos mais modernos incluem a avaliação do sangue pela técnica de PCR (Wosniak et al., 1994).

Miyamoto & Mello (2007) estudaram a relação entre a infecção por Hepatozoon spp. e a incidência da fragmentação do DNA e consequente morte de eritrócitos em C. durissus terrificus. Os resultados apontaram um aumento da fragmentação do DNA e condensação da cromatina típica de eritrócitos mortos na circulação, sugerindo que tal infecção acelere a destruição de eritrócitos em C. durissus terrificus, afetando não somente as células parasitadas, como também células normais.

Critério taxonômico para identificação de Hepatozoon spp.

O critério taxonômico para identificação de Hepatozoon spp. tem sido baseado principalmente na caracterização morfológica dos gamontes no sangue do hospedeiro vertebrado e dos estágios esporogônicos no hospedeiro invertebrado. Contudo, o fato da indiscutível semelhança entre os oocistos e entre os gamontes de diversas espécies de

Hepatozoon torna falha a identificação baseada somente nessas características (Pessoa & De Biasi, 1973 a,b; O’Dwyer et al., 2002 a,b).

A grande maioria dos trabalhos descritivos sobre Hepatozoon spp. de serpentes brasileiras trazia somente informações sobre morfologia dos gamontes (formato, coloração, presença de cápsula) e dados morfométricos, que geralmente limitavam-se à descrição do comprimento e largura dos gamontes e cistos. Porém, outras variáveis como medidas de área do parasita e do seu núcleo têm sido utilizadas, assim como, metodologias empregando técnicas moleculares (Telford Jr et al., 2004, Rubini et al., 2005b) e sistemas computacionais de análise de imagens para a biometria dos parasitas (Silva et al., 1999 a,b; Moço et al., 2002).

Contudo, para todos esses aspectos, encontramos na literatura dados conflitantes, devido, geralmente, à discrepância entre as técnicas antigas e recentes utilizadas em tais pesquisas. Outro fator a ser considerado é a baixa especificidade aos hospedeiros vertebrados e invertebrados, assim, uma mesma espécie de Hepatozoon pode parasitar mais de uma espécie de serpente, e uma única serpente pode ser parasitada por mais de uma espécie de Hepatozoon (Smith, 1996).

Prevalência de Hepatozoon spp. em serpentes

Até pouco tempo, eram raros os estudos sobre prevalência e caracterização de espécies de Hepatozoon em serpentes brasileiras. Em um destes estudos, foi relatada prevalência de 62% para Boa constrictor, 24% para Bothrops jararaca e 1% para C. durissus terrificus (Pessoa et al., 1974). Contudo, não há informação se esses animais foram recém capturados da natureza ou se já estavam em cativeiro por algum período de tempo. É válido notar que as prevalências em animais em condições de cativeiro podem não corresponder às prevalências em condições naturais.

O’Dwyer et al. (2003a), pesquisando somente animais recém capturados, relataram prevalência de 16,4% de infecção para Hepatozoon spp., com positividade de 38,9% para Boa constrictor amarali, 35,3% para Bothrops jararaca e 19,4% para C. durissus terrificus .

Moço et al. (2007), em um estudo realizado com 906 serpentes recém capturadas e doadas ao CEVAP – Centro de Estudos e Venenos de Animais Peçonhentos – UNESP, Botucatu, São Paulo; pertencentes a 3 espécies procedentes de 46 municípios do Estado de São Paulo, um município do Estado do Mato Grosso e outro do Estado do Paraná, relataram a infecção por Hepatozoon spp. em 125 (13,8%) serpentes. As prevalências da infecção em serpentes peçonhentas e não peçonhentas foram 15,1% e 8,7%, respectivamente. As espécies com taxa de infecção mais significativas foram 21,8% em B. jararaca, 19,1% em B. constrictor amarali e 15,8% em C. durissus. Os municípios onde ocorreram maiores taxas de infecção foram Conchas, Itatinga e Pardinho com, respectivamente, 47,6%, 26,7% e 17,1% de positividade para Hepatozoon spp.

Descrição de Hepatozoon spp. parasitas de serpentes brasileiras

A descrição da maior parte das espécies de Hepatozoon de serpentes foi baseada apenas em características morfológicas de gamontes e formas esporogônicas, o que sugere dados subestimados para esses parasitas (Tabela 1). Por outro lado, várias descrições tiveram como base somente a espécie do hospedeiro e uma mesma espécie de Hepatozoon pode ter recebido vários nomes, de acordo com a espécie de serpente.

Além das espécies já descritas para C. durissus terrificus, Hepatozoon romani e

Hepatozoon capsulata (Phisalix, 1931a), foram diagnosticados, na mesma espécie de serpente, gamontes que diferiam destes e que poderão, futuramente, ser caracterizados como novas espécies (Moço et al., 2002; O’Dwyer et al., 2003b).

Moço et al. (2002) observaram um exemplar de C. durissus terrificus infectado com

Hepatozoon sp. cujos gamontes apresentavam corpo afilado e alongado, citoplasma claro, sem granulações e núcleo denso e homogêneo localizado centralmente ou ligeiramente deslocado para uma das extremidades. As dimensões desses gamontes foram 3,2 ± 4,1µm2 de área, 14,7 ± 0,6 µm de comprimento e 2,4 ± 0,4 µm de largura. O’Dwyer et al. (2003b) descreveram uma pequena espécie de Hepatozoon, encontrada em outro exemplar de C. durissus terrificus, cujos gamontes eram menores dos que os usuais e apresentavam citoplasma claro, sem granulações e núcleo grande ocupando boa parte do citoplasma. Suas dimensões foram 24,6 ± 3,0 µm2 de área, 8,1 ± 0,5 µm de comprimento e 3,8 ± 0,4 µm de largura. A parasitemia observada foi extremamente elevada (56,6%), o que também é incomum, e os parasitas alteravam acentuadamente as hemácias infectadas. Além destas formas observadas, têm sido examinadas no Departamento de Parasitologia, IBB, exemplares de C. durissus terrificus infectadas com vários outros tipos de gamontes de Hepatozoon spp., demonstrando que o número de espécies desse gênero infectando essa espécie de serpente pode ser muito maior do que o já descrito na literatura (O’Dwyer et al., 2002 a,b, 2004).

Tabela 1. Espécies de Hepatozoon descritas e/ou relatadas em serpentes brasileiras.

Espécie de Hepatozoon Hospedeiro vertebrado Referência

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