Manual para Quantificação de Atividade de Enzimas relacionadas com a resistência a inseticidas Aedes aegypti, Manuais, Projetos, Pesquisas de Enfermagem

Baixe Manual para Quantificação de Atividade de Enzimas relacionadas com a resistência a inseticidas Aedes aegypti e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Enfermagem, somente na Docsity! Metodologia para Quantificação de Atividade de Enzimas Relacionadas com a Resistência a Inseticidas em Aedes aegypti Quantification Methodology for Enzyme Activity Related to Insecticide Resistance in Aedes aegypti MInIstéRIo dA sAúdE Brasília/dF MANUAL_LAFICAVE_CAPA.indd 1 4/12/2006 12:20:02 Metodologia para Quantificação de Atividade de Enzimas Relacionadas com a Resistência a Inseticidas em Aedes aegypti Quantification Methodology for Enzyme Activity Related to Insecticide Resistance in Aedes aegypti ÍNDICE PREFÁCIO 8 AGRADECIMENTOS 12 1. INTRODUÇÃO 14 2. ABREVIATURAS 18 3. EQUIPAMENTOS E REAGENTES 20 3.1. Equipamentos 20 3.2. Vidraria e plásticos 20 3.3. Miscelânea 22 3.4. Reagentes 22 3.4.1. reagentes de uso geral para os testes 22 3.4.2. reagentes específicos 24 4. PREPARAÇÃO DOS MOSQUITOS PARA TESTE 26 4.1. Congelamento 26 4.2. Homogeneização 26 4.3. Distribuição de homogenatos nas placas 30 4.3.1. preparo da “placa de mosquitos” 30 4.3.2. distribuição de amostras nas placas-teste 32 5. TESTES ENZIMÁTICOS 34 5.1. Acetilcolinesterase (ACE) 36 5.2. Oxidases de Função Mista (MFO) 38 5.2.1. curva-padrão de citocromo C 40 5.3. Esterase alfa (a-EST) 40 5.3.1. curva-padrão de alfa-naftol 44 5.4. Esterase beta (b-EST) 44 5.4.1. curva-padrão de beta-naftol 46 5.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST) 48 5.6. Glutationa-S-transferase (GST) 48 5.7. Proteínas totais (PTN) 50 5.7.1. curva-padrão de proteína – alternativa 1 52 5.7.2. curva-padrão de proteína – alternativa 2 54 5.7.3. posição das amostras de BSA para a curva-padrão 54 6. PREPARAÇÃO DE REAGENTES ESPECÍFICOS 56 6.1. Acetilcolinesterase (ACE) 56 6.2. Oxidases de Função Mista (MFO) 58 6.3. Esterase alfa (a-EST) 60 6.4. Esterase beta (b-EST) 62 INDEX PREFACE 9 ACkNOwlEDGEMENTS 13 1. INTRODUCTION 15 2. ABREVIATIONS 19 3. EQUIPMENT AND REAGENTS 21 3.1. Equipment 21 3.2. Glassware and plasticware 21 3.3. Miscellaneous 23 3.4 Reagents 23 3.4.1. reagents of general use 23 3.4.2. specific reagents 25 4. PREPARING MOSQUITOES 27 4.1. Freezing 27 4.2. Homogenization 27 4.3. Distribution of the homogenates in the microplates 31 4.3.1. preparing the “mosquito plate” 31 4.3.2. distributing samples in the test microplates 33 5. ENZYMATIC TESTS 35 5.1. Acethylcholinesterase (ACE) 37 5.2. Mixed Function Oxidases (MFO) 39 5.2.1. cytochrome C standard curve 41 5.3. alpha-Esterase (a-EST) 41 5.3.1. alpha-naphthol standard curve 45 5.4. beta-Esterase (b-EST) 45 5.4.1. beta- naphthol standard curve 47 5.5. “PNPA” Esterase (PNPA-EST) 49 5.6. Glutathione-S-transferase (GST) 49 5.7. Total proteins (PTN) 51 5.7.1. protein standard curve – alternative 1 53 5.7.2. protein standard curve – alternative 2 53 5.7.3. distribution of BSA samples for the standard curve 55 6. PREPARING SPECIFIC REAGENTS 57 6.1. Acethylcholinesterase (ACE) 57 6.2. Mixed Function Oxidases (MFO) 59 6.3. alfa-Esterase (a-EST) 61 6.4. beta-Esterase (b-EST) 63 6.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST) 64 6.6. Glutationa-S-transferase (GST) 66 6.7. Proteínas totais (PTN) 68 7. TAMPÕES GERAIS E SOlUÇÕES-ESTOQUE 70 7.1. Tampões fosfato de sódio 70 7.1.1. estoques fosfato de sódio (mono e bibásico) a 1 M 70 7.1.2. tampões- estoque fosfato de sódio a 1 M 72 7.1.3. tampões fosfato de sódio a 100 e 50 mM 72 7.1.4. tampão fosfato de sódio a 20 mM 72 7.2. Tampões fosfato de potássio 74 7.2.1. estoques fosfato de potássio (mono e bibásico) a 1 M 74 7.2.2. tampões-estoque fosfato de potássio a 1 M 76 7.2.3. tampão fosfato de potássio a 90 mM pH 7,2 76 7.2.4. tampão fosfato de potássio a 100 mM pH 6,5 76 7.3. Tampão acetato de sódio 78 7.3.1. tampão estoque acetato de sódio 250 mM pH 5,0 78 7.4. Propoxur (ensaio Acetilcolinesterase) 78 7.5. SDS (ensaio Esterases alfa e beta) 78 8. COMPARAÇÃO PROTOCOlOS OMS – CDC – lAFICAVE 80 9. ANÁlISE DOS RESUlTADOS 84 9.1. Acetilcolinesterase (ACE) 84 9.2. Proteínas totais (PTN) 84 9.3. Oxidases de Função Mista (MFO) 86 9.4. Esterases alfa e beta (a e b-EST) 88 9.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST) 88 9.6. Glutationa-S-transferase (GST) 90 10. METODOlOGIA lAFICAVE PARA PROCESSAMENTO E ANÁlISE DOS RESUlTADOS 92 10.1. Arquivo 1 – transferência dos dados do Soft Max para Excel 94 10.2. Arquivo 2 – conversão dos valores de absorbância (exceção de PNPA-EST) 98 10.3. Arquivo 3 – conversão dos valores de absorbância de PNPA-EST 108 10.4. Arquivo 4 – total dos dados de cada população 114 11. INTERPRETAÇÃO DOS RESUlTADOS 118 11.1. Critérios para inclusão de avaliações de mosquitos individuais 118 11.2. Critérios para classificação das populações 120 12. REFERÊNCIAS BIBlIOGRÁFICAS 126 Insecticide resistance mechanisms quantification | 9 PREFACE One of the tools employed in the dengue control is the application of insecticides to control its vector. In this context, monitoring the resistance status of Aedes aegypti populations, as well as detecting biochemical mechanisms implicated with resistance are very important parameters to define control strategies of this vector. The publication of this handbook that gives detailed instructions to the quantification, in Aedes aegypti, of the activity of enzymes related to insecticide resistance, through methodologies adapted to our conditions, fulfills an important gap and will enable the Laboratories of the Brazilian Aedes aegypti Resistance Monitoring Network to ac- complish these biochemical assays coordinately and in a better way. On the other hand, monitoring activities will provide the Health Surveillance Secre- tary/Brazilian Dengue Control Program General Coordination relevant information to help the rational control of the dengue vector in the country. With this publication, the Health Surveillance Secretary, together with the Labora- tory of Physiology and Control of Arthropod Vectors/Oswaldo Cruz Foundation/Rio de Janeiro, presently National Reference Laboratory of the Brazilian Aedes aegypti Insecticide Resistance Monitoring Network, accomplishes its role in the scope of the National Health Surveillance System, contributing to a higher effectiveness in the control actions of an important disease in the context of the epidemiological profile of the country. Fabiano Geraldo Pimenta Júnior Health Surveillance Secretay PREFÁCIO A detecção e a caracterização iniciais de um caso de resistência a inseticidas são geral- mente obtidas por meio da realização de algum tipo de bioensaio. Bioensaios são con- duzidos para responder à pergunta: Este inseticida vai controlar este vetor neste local, neste momento? Esta é a questão prática fundamental que o agente de controle opera- cional precisa responder, preferencialmente antes que o inseticida seja adquirido. Sempre que resistência é detectada, surge a questão: O que eu faço agora? É para res- ponder a esta questão que métodos bioquímicos e moleculares foram desenvolvidos, para detectar e avaliar, em insetos individuais, os mecanismos de resistência e o poten- cial de resistência cruzada e sua especificidade para tipos particulares de inseticidas. Ensaios bioquímicos de resistência baseados em microplacas foram inicialmente de- senvolvidos no Centro de Controle de Doenças, em Atlanta, no final dos anos 1970. Na medida em que sua utilização foi expandida, várias modificações do protoco- lo foram feitas. Estas modificações foram principalmente conseqüência da variação dos conjuntos de filtros disponíveis em espectrofotômetros comerciais para leitura de microplacas e da conveniência de laboratórios particulares no uso de diferentes proporções de reagentes, tampões mais convenientes e fatores de diluição dos homo- genatos de insetos. Em geral, acredita-se que dois protocolos sejam mais amplamente utilizados: os protocolos do CDC e da Organização Mundial de Saúde. Contudo, a força de qualquer protocolo reside em sua capacidade de preencher as necessi- dades de programas de controle específicos. Por esta razão, protocolos modificados e pro- tocolos originais devem ser encorajados sempre que preencherem as necessidades opera- cionais de um país ou programa. O único requisito é que o protocolo do ensaio represente acurada e precisamente a bioquímica da resistência a inseticidas em insetos individuais. O protocolo do LAFICAVE aqui descrito preenche estes requisitos, como eu verifiquei pes- soalmente, e corresponde a uma valiosa adição à nossa gama de métodos para abordar a ques- tão crucial da detecção e descrição, em termos práticos, da resistência em vetores de doenças. Os autores procuraram fornecer um manual prático, orientado para o laboratório, incluindo um CD-ROM extremamente útil, que deixará o usuário com a sensação de segurança de saber exatamente o que está sendo feito quando da execução destes testes. Grande cuidado foi empregado na avaliação empírica de todos os aspectos da metodologia. No CDC, estamos planejando ligar este protocolo ao nosso website de treinamento em resistência, enfatizando que uma metodologia consistente deve ser moldada para preencher as necessidades de programas. William G. Brogdon, Ph.D. Pesquisador Entomologista Senior Seção de Entomologia Divisão de Doenças Parasitárias Centro Nacional de Doenças Infecciosas Centros de Controle e Prevenção de Doenças Atlanta, Geórgia, EUA 30341 10 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas PREFACE The initial detection and characterization of an instance of insecticide resistance is generally accomplished using some form of bioassay. Bioassays are conducted to answer the question: Will this insecticide control this vector at this place at this time? This is the fundamental practical question that operational control personnel must have answered, preferably before the insecticide is purchased. Where resistance is found, the question then becomes: What do I do now? It is to an- swer this question that biochemical and molecular methods were developed for de- tecting and assessing in individual insects insecticide resistance mechanisms and the potential for cross resistance and its specificity for particular types of insecticides. Microplate based biochemical resistance assays were initially developed at the Cen- ters for Disease Control in Atlanta in the late 70s. As they were more widely used, a number of modifications in protocol occurred. These were mainly due to the varying filter sets available in commercial micropolate-reading spectrophotometers and to the convenience in particular labs of using different proportions of reagents, more conve- nient buffers and dilution factors of insect homogenates. In general, two protocols have perhaps been most widely used: the CDC and World Health Organization protocols. However, the strength of any protocol lies in its adaptability to fulfill the needs of spe- cific control programs. For that reason, modified protocols and original protocols are to be encouraged where they fill an operational need in a country or program. The only caveat is that the assay protocol represent accurately and precisely the biochem- istry of insecticide resistance in individual insects. The LAFICAVE protocol described herein fulfills these requirements, as I have per- sonally verified, and should prove to be a valuable addition to our tool kit of methods for addressing the crucial issue of detecting and describing in practical terms resis- tance in vectors of disease. The authors are seeking to provide a practical lab-oriented manual, including what will be a most useful CD rom, that will leave the user with the secure feeling that they know exactly what they are doing when performing these tests. Great care has been exercised in an empirical assessment of every aspect of the methodology. At CDC, we are planning to link this protocol to our resistance training website, further em- phasizing that a robust methodology can be tailored to fit the needs of programs. William G. Brogdon, Ph.D. Senior Fellow and Research Entomologist Entomology Branch Division of Parasitic Diseases National Center for Infectious Diseases Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia, U.S.A. 30341 Insecticide resistance mechanisms quantification | 11 1. INTRODUÇÃO Os inseticidas químicos desempenham até hoje um papel importante no controle de vetores transmissores de doenças. Os mais amplamente usados atuam no sistema nervoso central (SNC) dos insetos e são classificados em quatro grandes grupos, de acordo com a sua natureza química: organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides. O aparecimento de insetos resistentes a estes compostos decorre prin- cipalmente de uma alteração nos seus sítios de ação ou de maior eficiência de deto- xificação. Este último mecanismo é conhecido como resistência metabólica e o au- mento da atividade de enzimas detoxificantes (Glutationa-S-transferases, Esterases, Oxidases de Função Mista) contribui para a eliminação ou inativação dos inseticidas circulantes no organismo do vetor. O uso de inseticidas no Brasil, desde 1967, vem expondo o vetor do dengue a uma intensa pressão seletiva. Portanto, é de extrema relevância para o controle analisar o status de resistência de populações de Aedes aegypti e o mecanismo envolvido. Méto- dos bioquímicos podem detectar precocemente o aparecimento de indivíduos alte- rados, fornecendo informações sobre o mecanismo de resistência de uma população, assim como o padrão de resistência cruzada frente aos inseticidas empregados. Este manual foi elaborado com o objetivo de fornecer instruções detalhadas para a quantificação, em A. aegypti, da atividade de enzimas associadas à resistência a insetici- das. O trabalho é parte das atividades do MoReNAa (Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti aos Inseticidas), grupo que congrega laboratórios que atuam em sintonia com o PNCD (Programa Nacional de Controle da Dengue), na ten- tativa de fornecer subsídios para o controle racional do vetor de dengue no país. Os protocolos que este manual descreve foram resultado de modificações nos mé- todos recomendados pela Organização Mundial de Saúde (Hemingway 1998) e pelo Centers for Disease Control (Insecticide Resistance Workshop 1998), de forma a ade- quá-los às nossas condições e necessidades. Estes protocolos estão sendo utilizados com sucesso por nossa equipe desde 2002. Os principais parâmetros avaliados foram: volume de homogeneização dos mosqui- tos, natureza e concentração dos tampões e demais reativos, volumes de extratos usa- dos em cada ensaio e tempos de reação. Foi adotado o uso de duplicatas de todos os espécimes e avaliou-se ainda o efeito da centrifugação sobre a quantificação das Oxidases de Função Múltipla, enzimas associadas a membranas (Montellano 2004). Adicionalmente, optou-se pela inclusão de mosquitos susceptíveis a inseticidas, de uma cepa referência, como controles internos, em cada ensaio (nós usamos mosquitos da cepa Rockefeller). 14 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 1. INTRODUCTION Chemical insecticides have up now played an important role in the insect disease vec- tors control. In Public Health, the more widely used insecticides act on the insect cen- tral nervous system (CNS) and are classified in four major groups, according to their chemical nature: organochlorines, organophosphates, carbamates and pyrethroids. Insects become resistant to these compounds as a result of either an alteration in their target sites or an increased detoxification efficacy. The latter mechanism is known as metabolic resistance, and the increase in the activity of detoxifying enzymes (Glutha- tione-S-Transferases, Esterases, Mixed Function Oxidases) contributes to the elimi- nation or deactivation of the insecticides circulating the vector’s organism. In Brazil, as a consequence of the use of insecticides since 1967, dengue vector popu- lations are exposed to an intense selection pressure. In this sense the analysis of both the resistance status of wild populations and the mechanisms involved is of relevance to the control of Aedes aegypti. Biochemical methods can be responsible for the early detection of altered specimens, yielding information concerning the resistance mechanisms of a given population as well as a pattern of cross resistance to different insecticides. This handbook was prepared in order to give detailed instructions to the quantifica- tion of the enzyme activity related to insecticide resistance in A. aegypti. The work is part of MoReNAa (Brazilian Aedes aegypti Insecticide Resistance Monitoring Net- work) activities, a group of laboratories that act together with the PNCD (Brazilian Dengue Control Program) and give support to the rational control of the dengue vector in the country. The protocols described in this handbook are the result of modifications in the pro- cedures recommended by the World Health Organization (Hemingway 1998) and by the Centers for Disease Control (Insecticide Resistance Workshop 1998) in order to adapt the methodology to our conditions and needs. These protocols have been utilized with success by our group since 2002. The main parameters evaluated were: mosquito homogenization volume, nature and concentration of buffers and reactives, size of the aliquots of mosquito homogenate used in each assay and reaction time. We opted to use duplicate samples for all en- zymes. We also evaluated the effect of centrifugation on the quantification of Mixed Function Oxidases, since these enzymes are known to be associated with membranes (Montellano 2004). Furthermore, internal controls, corresponding to mosquitoes of the insecticide susceptible reference strain (we use Rockefeller mosquitoes), were in- cluded in each assay. Insecticide resistance mechanisms quantification | 15 Nossa intenção é testar outros parâmetros, como a expressão diferencial nos dois sexos, ao longo do desenvolvimento ou em adultos de diferentes idades. Atualmente, trabalhamos com fêmeas adultas, um dia após a emergência. Com relação aos adul- tos, o método CDC utiliza apenas fêmeas, enquanto o método OMS admite também o uso de machos. Por outro lado, enquanto a OMS utiliza apenas adultos jovens, de um dia, o CDC não faz nenhuma restrição nesse sentido. Contudo, pode haver di- ferença temporal na expressão das enzimas envolvidas com a resistência. Expressão diferencial entre larvas e adultos pode ser relevante para o monitoramento da resis- tência, quando é necessário confrontar os bioensaios e os ensaios bioquímicos. Foram definidos protocolos para a quantificação de Acetilcolinesterase, enzima-alvo, no SNC, de organofosforados e carbamatos, e das principais enzimas envolvidas com a resistência metabólica. Estas, em conjunto, podem ser importantes para a resistên- cia aos grupos de inseticidas mais amplamente empregados em saúde pública. As Esterases estão sendo quantificadas com três substratos diferentes. Todos os ensaios quantificam a atividade enzimática, com exceção do teste de Oxidases de Função Mista (MFO), que é uma medida indireta do conteúdo da enzima, uma vez que quan- tifica o grupamento heme, seu grupamento prostético (ver Seção 9.3). O texto foi organizado em seções para facilitar a consulta, desde o congelamento dos mosquitos até a interpretação dos resultados. Detalhes da preparação dos reagentes e dos tampões também podem ser encontrados em seções separadas. Finalmente, em associação com este manual, foram elaboradas planilhas, no programa Excel, que permitem, de forma semi-automática, a comparação das réplicas de cada amostra, a transformação dos valores de absorbância em atividade enzimática, a correção pela quantidade de proteínas totais em cada mosquito e a elaboração de gráficos que mos- tram o perfil de atividade de cada população analisada. Esperamos que este trabalho possa contribuir com o monitoramento que vem sendo executado, na medida em que outros laboratórios envolvidos com a avaliação da re- sistência de Aedes aegypti no país possam utilizá-lo. Por outro lado, o material aqui detalhado poderia servir como roteiro inicial para a avaliação dos mecanismos de resistência de outras espécies. Embora tenha sido inicialmente planejado para utili- zação pelo MoReNAa, fomos posteriormente encorajados a apresentar este material para um público mais amplo, o que justifica a versão em inglês. 16 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 2. ABREVIATIONS ACE Acethylcholinesterase AChE total activity of Acethylcholinesterase AChI Acethylcholinesterase activity in the presence of an inhibitor ACTH acetylthiocholine iodide BSA bovine serum albumin cit cytochrome CDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzene DIA o-dianisidine, tetrazotized DTNB 5,5’-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) EST Esterase GSH glutathione GST Glutathione-S-transferase H2O2 hydrogen peroxide k phosph potassium phosphate MFO Mixed Function Oxidases Na acet sodium acetate PNPA p-nitrophenyl acetate PTN proteins TMBZ 3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine dihydrochloride Insecticide resistance mechanisms quantification | 19 3. EQUIPAMENTOS E REAGENTES 3.1. Equipamentos n Máquina de produzir gelo (em flocos) n Sistema de purificação de água (grau reagente) n Microcentrífuga para tubos tipo Eppendorf n Espectrofotômetro, leitor de microplacas (Versa-Max, da Molecular Devices) n Pipetas monocanal, P20, P200 e P1000, volumes variáveis n Pipeta multicanal (12 canais), 5 a 50 µl n Pipeta multicanal (12 canais), 30 a 300 µl ou 50 a 300 µl n pHmetro n Balança analítica n Geladeira n Congelador a -20ºC n Congelador a -80ºC n Agitador magnético 3.2. Vidraria e plásticos n Becheres de 20 – 25 – 150 – 600 – 1000 ml n Garrafas (de preferência transparentes) de 500 e 1000 ml n Provetas de 10 – 50 – 100 – 500 – 1000 ml n Tubos tipo Falcon de 15 e 50 ml n Reservatórios de reagentes para pipetas multicanal (Sigma – nº cat.: R1525). n microplacas de 96 poços, com fundo em U e capacidade de 300 µl da NUNC (Thomas Scientific nº cat.: 6106U07) n Ponteiras para pipetas automáticas mono e multicanal 20 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 3. EQUIPMENT AND REAGENTS 3.1. Equipment n Ice machine (flaked ice) n Water purification system (reagent grade water) n Microcentrifuge for Eppendorf tubes n Microplates spectrophotometer (Versa-max, Molecular Devices) n Single channel pipettes, P20, P200 and P1000, variable volumes n Multichannel pipette (12 channels), 5 to 50 µl n Multichannel pipette (12 channels), 30 to 300 µl or 50 to 300 µl n pH Meter n Analytical balance n Refrigerator n Freezer -20�C n Freezer -80�C n Magnetic stirrer 3.2. Glassware and plasticware n Beakers (volumes: 20 – 25 – 150 – 600 – 1000 ml) n Bottles (preferably transparent)(volumes: 500 and 1000 ml) n Graduated cylinders (volume: 10 – 50 – 100 – 500 – 1000 ml) n Falcon Tubes (volumes: 15 and 50 ml) n Pipetting reservoir (Sigma – nº cat: R1525) n 96-well NUNC microplates, round-bottom, well volume: 300 µl (Thomas Scientific cat nº: 6106U07) n Tips for single and multichannel automatic pipettes | 21 e n zi m a re a g e n te fa b ri ca n te n ° ca tá lo g o P M e m b a la g e m te m p e st o q u e q u a n t / t e st e n ° te st e s/ fr a sc o A C E D TN B Si g m a D 81 30 39 6, 4 Fr as co 5 g 4º C ( ** ) 0, 01 2 g 41 6 A C TH ( *) Si g m a A 57 51 28 9, 2 Fr as co 5 g -2 0º C 0, 01 74 g 28 7 Pr o p o xu r Si g m a 45 64 4 20 9, 2 Fr as co 2 50 m g 4º C ( ** ) 0, 12 81 m g 1. 95 0 M FO C it o cr o m o C Si g m a C 31 31 12 ,3 Fr as co 1 00 m g -2 0º C 0, 01 m g 10 .0 00 TM B z (* ) Si g m a T8 76 8 31 3, 3 Fr as co 5 g 4º C 0, 01 2 g 41 6 m et an o l M er ck 10 6. 00 9 32 ,0 4 Fr as co 1 l Te m p a m b 7 m l 14 2 ác id o a cé ti co g la ci al Si g m a A -6 28 3 60 ,0 5 Fr as co 5 00 m l Te m p a m b (# ) (# ) H 2O 2 a 30 % Si g m a 21 ,6 76 -3 34 ,0 1 Fr as co 1 00 m l 4º C ( ** ) 30 0 µ l 33 3 ES T b et a- n af ti l a ce ta to Si g m a N 68 75 18 6, 2 Fr as co 2 5 g -2 0º C 1, 4 m g 17 .8 57 al fa -n af ti l a ce ta to Si g m a N 85 05 18 6, 2 Fr as co 2 5 g -2 0º C 1, 4 m g 17 .8 57 b et a- n af to l ( *) Si g m a N 12 50 14 4, 2 Fr as co 5 0 g Te m p a m b 0, 07 5 m g 66 6. 66 6 al fa -n af to l Si g m a N 27 80 14 4, 2 Fr as co 1 0 g Te m p a m b 0, 07 5 m g 13 3. 33 3 SD S B io -R ad 16 1- 03 02 28 8, 38 Fr as co 1 k g Te m p a m b 0, 52 5 g 1. 90 4 Fa st B lu e (* ** ) Si g m a D 98 05 47 5, 5 Fr as co 1 0 g 4º C 0, 04 5 g 22 2 PN PA Si g m a N 81 30 18 1, 2 Fr as co 5 g -2 0º C 0, 00 45 g 1. 11 1 ac et o n it ri la Si g m a 36 ,0 45 -7 41 ,0 5 Fr as co 5 00 m l Te m p a m b 25 0 µ l 50 0- 20 00 ( ## ) ac et o n a M er ck 10 0. 01 4 58 ,0 8 Fr as co 1 l Te m p a m b 50 0 µ l 2. 00 0 G ST G SH Si g m a G 65 29 30 7, 3 Fr as co 5 g 4º C 0, 06 15 g 81 C D N B Si g m a C -6 39 6 20 2, 6 Fr as co 5 g 4º C ( *) 0, 00 42 g 1. 19 0 PT N t o ta is p ro te in a ss ay B io -R ad 50 0- 00 06 Fr as co 4 50 m l 4º C 8 m l 56 B SA a 2 m g /m l Pi er ce 23 20 9 A m p o la 1 m l 4º C ( *) 60 µ l 16 (* ) R ea g en te f o to ss en sí ve l. G u ar d ar a o a b ri g o d a lu z. (* *) E m b o ra a r ec o m en d aç ão o ri g in al s ej a p ar a o e st o q u e d es te s re ag en te s à te m p er at u ra a m b ie n te , n o la b o ra tó ri o e le s sã o m an ti d o s a 4º C , e m f u n çã o d e n o ss o c lim a tr o p ic al . (* ** ) O u d ia n is id in a (# ) ve r S e çã o 7 .3 .1 , a . (# #) v er S e çã o 6 .5 . 3.4.2. reagentes específicos 24 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 3.4.2. specific reagents e n zy m e re a g e n t m a n u fa ct u re r ca t n ° M w p a ck a g in g te m p s to ra g e q u a n ti ty /t e st n ° te st s/ p a ck A C E D TN B Si g m a D 81 30 39 6. 4 5 g fl as k 4º C ( ** ) 0. 01 2 g 41 6 A C TH ( *) Si g m a A 57 51 28 9. 2 5 g fl as k -2 0º C 0. 01 74 g 28 7 p ro p o xu r Si g m a 45 64 4 20 9. 2 25 0 m g fl as k 4º C ( ** ) 0. 12 81 m g 1. 95 0 M FO cy to ch ro m e C Si g m a C 31 31 12 .3 10 0 m g fl as k -2 0º C 0. 01 m g 10 .0 00 TM B z (* ) Si g m a T8 76 8 31 3. 3 5 g fl as k 4º C 0. 01 2 g 41 6 m et h an o l M er ck 10 6. 00 9 32 .0 4 1 l fl as k R o o m t em p 7 m l 14 2 ac et ic a ci d g la ci al Si g m a A -6 28 3 60 .0 5 50 0 m l fl as k R o o m t em p (# ) (# ) 30 % H 2O 2 Si g m a 21 ,6 76 -3 34 .0 1 10 0 m l fl as k 4º C ( ** ) 30 0 µ l 33 3 ES T b et a- n ap h th yl a ce ta te Si g m a N 68 75 18 6. 2 25 g fl as k -2 0º C 1. 4 m g 17 .8 57 al ph a- na ph th yl a ce ta te Si g m a N 85 05 18 6. 2 25 g fl as k -2 0º C 1. 4 m g 17 .8 57 b et a- n ap h th o l ( *) Si g m a N 12 50 14 4. 2 50 g fl as k R o o m t em p 0. 07 5 m g 66 6. 66 6 al p h a- n ap h th o l Si g m a N 27 80 14 4. 2 10 g fl as k R o o m t em p 0. 07 5 m g 13 3. 33 3 SD S B io -R ad 16 1- 03 02 28 8. 38 1 kg fl as k R o o m t em p 0. 52 5 g 1. 90 4 Fa st B lu e (* ** ) Si g m a D 98 05 47 5. 5 10 g fl as k 4º C 0. 04 5 g 22 2 PN PA Si g m a N 81 30 18 1. 2 5 g fl as k -2 0º C 0. 00 45 g 1. 11 1 ac et o n it ri le Si g m a 36 .0 45 -7 41 .0 5 50 0 m l fl as k R o o m t em p 25 0 µ l 50 0- 2. 00 0 (# #) ac et o n e M er ck 10 0. 01 4 58 .0 8 1 l fl as k R o o m t em p 50 0 µ l 2. 00 0 G ST G SH Si g m a G 65 29 30 7. 3 5 g fl as k 4º C 0. 06 15 g 81 C D N B Si g m a C -6 39 6 20 2. 6 5 g fl as k 4º C ( *) 0. 00 42 g 1. 19 0 to ta l P TN p ro te in a ss ay B io -R ad 50 0- 00 06 45 0 m l fl as k 4º C 8 m l 56 B SA , 2 m g /m l Pi er ce 23 20 9 1 m l v ia l 4º C ( *) 60 µ l 16 (* ) lig h t se n si ti ve r ea g en t. S to re p ro te ct ed f ro m li g h t. (* *) A lt h o u g h s to ra g e o f th es e re ag en ts a t ro o m t em p er at u re is o ri g in al ly r ec o m m en d ed , i n t h e la b o ra to ry w e ke ep t h em a t 4º C , b ec au se o f o u r tr o p ic al c lim at e. (* ** ) al so d ia n is id in e. (# ) se e S e ct io n 7 .3 .1 a . (# #) s ee S e ct io n 6 .5 . Insecticide resistance mechanisms quantification | 25 4. PREPARAÇÃO DOS MOSQUITOS PARA TESTE 4.1. Congelamento a) São usadas fêmeas adultas de um dia de idade (0 a 24 horas após emergência), NÃO alimentadas com sangue2. b) As fêmeas das populações a serem testadas são colocadas, ainda vivas, em tubos tipo Eppendorf, em grupos de 40-50. Fêmeas de uma linhagem de referência, sus- ceptível a inseticidas, usadas como controle interno dos ensaios, são colocadas nos tubos tipo Eppendorf em grupos de sete (7). c) Os tubos são congelados imediatamente (fêmeas ainda vivas) a -70ºC3. d) Quando da utilização (Seção 4.2, c), retirar os tubos necessários do congelador para processamento, imediatamente antes do uso. Colocar no gelo. Não é reco- mendável recongelar mosquitos excedentes. 4.2. Homogeneização a) Distribuir 45 tubos tipo Eppendorf, numerados, sobre uma bacia com gelo. b) Adicionar 30 µl de água a cada tubo. Usar, preferencialmente, água tipo Milli-Q4. c) Retirar do congelador um tubo com 45-50 mosquitos fêmea da população a ser testada e um tubo com sete susceptível a inseticidas. d) Espalhar os mosquitos sobre uma bacia plástica (ou uma placa de Petri), colocada diretamente sobre o gelo. e) Distribuir os mosquitos nos tubos numerados (um por tubo). Nos tubos 1 a 40 coloque os mosquitos da população a ser testada e nos tubos 41-45, mosquitos controle, de uma cepa referência, susceptível.  De acordo com o manual da OMS (Hemingway 1998), não se recomenda usar mosquitos que foram diretamente expostos aos pesticidas antes de morrer.  De acordo com o manual da OMS (Hemingway 1998), insetos que morreram há mais que alguns minutos (e foram manti- dos à temperatura ambiente) têm níveis de enzimas seriamente reduzidos.  Não estoque nem autoclave água Milli-Q. Água de osmose reversa (Milli-RO) também pode ser usada. 26 | f) Homogenize each mosquito5,6, following the numbers defined for the tubes. Keep tubes iced during the whole homogenization procedure7. g) Add 270 µl of water to each tube. DO NOT pipette on the tube wall: if you pipette in the middle of the tube, mixing will be favored. Respect the numbers defined for the tubes (1-45). In this way, when the last tube is attained, the cell debris from the first samples will already have sunk to the bottom of the tube. You can now start the distribution of aliquots to the Acethylcholinesterase (ACE) and Mixed Func- tion Oxidases (MFO) assays (Sections 5.1 and 5.2). h) Before centrifugation, remove four aliquots, 25 µl each, to quantify ACE; each pair of aliquots in one separate 96-well microplate (see Section 4.3.2) 8. i) Before centrifugation, transfer two additional aliquots, 20 µl each, to one 96-well microplate, in order to quantify MFO8. j) Centrifuge the remaining homogenate (~160 µl) at 12.000 g for 60 seconds9,10. k) Remove tubes from the centrifuge and transfer to the basin containing ice. Keep tubes on ice while you distribute the homogenates, in order to reduce proteolysis11. l) Transfer to a new 96-well microplate (the “mosquito plate”, Section 4.3.1), about 130-150 µl of the supernatant from each homogenate12. From this point on, a multi-channel pipette can be used to distribute the aliquots.  Automatic homogenizers are very efficient. We use an adapted bench equipment, with pedal. Portable homogenizers, bat- tery-operated, are also indicated (Section 3.3).  Each mosquito is homogenized during 5-10 seconds, approximately. After homogenizing each mosquito, the pestle is wa- shed in a 100 ml capacity Beaker, containing 50 ml water. Water in the Beaker is not changed during all the procedure. After each washing, the pestle is dried with a Kleenex.  Once you started the homogenization, it is important to proceed quickly.  Avoid to ressuspend and to remove the decanted material at the bottom of the tube.  According to the WHO handbook (Hemingway 1998), the centrifugation step is important mainly to the GST dosage (particles can interfere with absorption at 340 nm, see Section 5.6). 0 Ideally use a refrigerated centrifuge. If only non-refrigerated centrifuges are available, do not centrifuge for more than 2 minutes. We use a microcentrifuge for Eppendorf tubes, at maximum speed.  According to the WHO handbook (Hemingway 1998), freezing at -20ºC immediately after the homogenization procedure keeps enzyme activity relatively constant for several hours. However, in our experience, it is important to perform the test as quickly as possible.  A total of 110 µl of each homogenate will be needed in the remaining quantifications (besides Acethylcholynesterase and MFO, already discriminated, items h and i). Facing page: homogenization detail of an individual mosquito, with an electric homogenizer Insecticide resistance mechanisms quantification | 29 4.3. Distribuição de homogenatos nas placas 4.3.1. preparo da “placa de mosquitos” Para facilitar os testes, 130-150 µl dos sobrenadantes dos homogenatos de mosquitos individuais são transferidos dos tubos tipo Eppendorf para uma placa de 96 poços (sempre no gelo), na seguinte ordem13: m = mosquito da população a ser testada R = mosquito da cepa referência, susceptível a inseticidas  Esta distribuição permite que a mesma placa seja utilizada para dois testes diferentes: no primeiro teste são usadas as linhas A-D e no segundo, as linhas E-H. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12 B m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24 C m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36 D m37 m38 m39 m4 0 R41 R42 R43 R44 R45 E F G H Transferência dos sobrenadantes de homogenatos de mosquitos para a “placa de mosquitos” 30 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 4.3. Distribution of the homogenates in the microplates 4.3.1. preparing the “mosquito plate” To speed up the tests, 130-150 µl of the supernatant from the homogenates of indi- vidual mosquitoes are transfered from the Eppendorf tubes to a 96-well microplate (always on the ice), in the following order13: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12 B m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24 C m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36 D m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45 E F G H m = mosquito from the population to be tested R = mosquito from the insecticide susceptible reference strain  This distribution enables the use of the same microplate in two tests: lines A-D ad lines E-H. Facing page: transfer of mosquito homogenate supernatants to the “mosquito plate” Insecticide resistance mechanisms quantification | 31 5. TESTES ENZIMÁTICOS Cada teste é sempre executado por duas pessoas ao mesmo tempo, para otimizar o processo. NÃO recomendamos que o teste completo (de todas as enzimas simultane- amente, 45 mosquitos) seja executado por uma só pessoa. O teste para cada enzima tem um protocolo e um tempo de reação diferente. No labo- ratório, definimos uma ordem de execução que facilita o teste rápido e sem atropelos de todas as enzimas: 1) Oxidases de Função Mista15 2) Acetilcolinesterase 3) Esterase-alfa15 4) Esterase-beta15 5) dosagem de proteínas 6) curva-padrão de proteína16 7) Esterase “PNPA” 8) Glutationa-S-transferase Com exceção da quantificação de atividade de MFO e ACE, que devem ser as pri- meiras enzimas a serem testadas, a ordem acima não é obrigatória, devendo cada laboratório determinar o fluxo de trabalho mais adequado à sua rotina.  Além dos testes com as enzimas, são realizadas curvas-padrão com substratos das MFO e das Esterases alfa e beta. Estas curvas são utilizadas para conversão dos valores de absorbância em atividade específica das enzimas. Em nossa rotina laboratorial, optamos por refazer as curvas-padrão com os substratos destas enzimas toda vez que iniciamos uma nova bateria de testes com as populações de campo (10 a 20 populações). Usamos como base para cálculo a média de pelo menos três curvas-padrão.  Uma nova curva-padrão de proteína é feita a cada teste. Embora possa ser feita a qualquer tempo durante o teste, recomen- da-se que seja realizada junto com a dosagem de proteínas. 34 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5. ENZYMATIC TESTS In order to optimize the procedure, each test is always performed simultaneously by two persons. We DO NOT recommend that a complete test (45 mosquitoes, all en- zymes simultaneously) be done by just one person. The test for each enzyme has a different protocol and a different reaction time. In the laboratory we defined an optimized sequence for all the reactions: 1) Mixed Function Oxidases15 2) Acethylcholinesterase 3) alpha-Esterase15 4) beta-Esterase15 5) total proteins 6) protein standard curve16 7) “PNPA” Esterase 8) Gluthatione-S-transferase This sequence of reactions is not obligatory, excluding MFO and ACE that are the first enzymes to be quantified. Each laboratory should define the sequence of reac- tions most convenient for its routine.  In addition to the quantification of this enzyme, it is necessary to do standard curves with the substrates of MFO and alpha- and beta-Esterases. These curves are necessary to the conversion of absorbance values in the specific activity of each enzyme. In our routine, we opted to construct new standard curves each time a new batch of tests with field populations starts (10-20 populations). We take into account the mean of at least three standard curves.  A new protein standard curve is done at each test. It can be done at any moment during the test. However, it is recomended that it is performed together with the protein dosage of the mosquito homogenates. | 35 5.1. Acetilcolinesterase (ACE) A tabela abaixo discrimina as soluções necessárias para este teste. Para consulta sobre os detalhes da preparação, consulte a Seção 6.1. a) Distribuir 25 µl de homogenato, antes da centrifugação, em duplicata, em duas placas. Uma placa receberá o nome de “AChE” e a outra, de “AChI”. Na placa AChE mede-se a atividade total de Acetilcolinesterase. Na placa AChI mede-se a atividade desta enzima quando na presença de um inibidor. O inibidor utilizado é propoxur, carbamato indicado para esta finalidade pelo manual da OMS (Hemin- gway 1998). b) Nos poços correspondentes aos “brancos” (6 poços: G10 a G12 e H10 a H12), adicionar 25 µl de água. c) Adicionar, em cada poço, 145 µl de Triton / Na fosfato. d) Adicionar, em cada poço, 10 µl DTNB / Na fosfato. e) Adicionar, na placa AchE, em cada poço, 25 µl da solução AchE. f) Adicionar, na placa AchI, em cada poço, 25 µl da solução AchI. (o volume final em cada poço é de 205 µl) g) Fazer a leitura (end point), após uma hora, das duas placas (AchE e AchI), a 405 nm. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 Triton/Na fosfato 29 ml 500 ml em estoque 2 DTNB/Na fosfato 2 ml 3 ml preparar antes do teste3 AChE 2,5 ml 3 ml 4 AChI 2,5 ml 3 ml Distribuição de homogenatos de mosquitos nas placas para teste de ACE. Página ao lado: detalhe da coloração resultante do teste ACE, nas placas AChE (painel da esquerda) e AChI (painel da direita), respectivamente com e sem propoxur. B: branco 36 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas Resulting color of MFO assay. B: blank; C: positive control. Facing page: mosquito homogenate distribution for MFO test (left panel) and distribution of reagents using a multichannel pipette (right panel) 5.2. Mixed Function Oxidases (MFO)  istest does not measure the enzymatic activity. It quanties the heme group that, in non blood-fed insects, is mainly associated with cytochrome P450 (see Section 9.3 for details).  eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.2. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 90 mM K phosph, pH 7.2 6 ml 500 ml in stock 2 0.01 mg/ml cytochrome C 60 µl 5 ml 3 TMBZ/Na acet 20 ml 24 ml freshly prepared 4 3% H2O2 2.5 ml 3 ml a) Distribute 20 µl of the homogenates, before centrifugation, in duplicate, in one microplate. b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12), add 20 µl of K phosph. c) In the “positive control” wells (3 wells: H10 to H12), add 20 µl of the solution cytochrome C (total per test: 0.2 ug cytochrome C)17. d) Add to each well 60 µl K phosph buer. e) Add to each well 200 µl of the working solution: TMBZ/Na acet. f) Add to each well 25 µl of 3% H2O2 (*). (the nal volume in each well is 305 µl) g) Incubate at room temperature and protected from light during 90 minutes. h) Read the absorbance at 650 nm (“end point”). 17  econcentration of cytochrome C used in the positive control was calibrated according to the standard curve and it is included in its linearity range. It is recommended to frequently observe the absorbance value of the positive control, generally very stable among successive tests. It is recommended to repeat the standard curve if the values observed for the cytochrome C are very dierent from the usual ones. ROCK Insecticide resistance mechanisms quantification | 39 5.2.1. curva-padrão de citocromo C Em nossa rotina laboratorial, optamos por refazer a curva toda vez que examinamos uma nova bateria de testes com as populações de campo. Consideramos, como base para cálculo de coeficiente angular, a ser utilizado na conversão de absorbância para ug de substrato (Seção 9.3), o valor da média de pelo menos três curvas-padrão. Adicionar, em duplicata, na mesma linha de uma placa, as seguintes quantidades de citocromo C, na concentração de 0,01 mg/ml: µg cit C µl cit C (0,01 mg/ml) µl k fosf 0,0 – 80 0,01 1 79 0,02 2 78 0,05 5 75 0,1 10 70 0,2 20 60 Proceder como para a dosagem nas amostras – Seção 5.1, e – h. 5.3. Esterase alfa (a-EST) A tabela abaixo discrimina as soluções necessárias para este teste. Para consulta sobre os detalhes da preparação, consulte a Seção 6.3. a) Distribuir 10 µl de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, em uma placa. b) Em cada um dos poços correspondentes aos “brancos” (três poços: G10 a G12) adicionar 10 µl de água. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 alfa-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque 2 alfa-naftil acetato/Na fosfato 20 ml 25 ml preparar antes do teste 3 Fast Blue 10 ml 15 ml 40 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5.2.1. cytochrome C standard curve In our laboratory routine, we opted to devise a new standard curve for every new bat- tery of tests with field populations. We consider the mean of at least three standard curves as a basis to calculate the angular coefficient that is utilized in the conversion of absorbance to µg substrate (Section 9.3). Add, in duplicate, in the same line of a microplate, the following quantities of 0.01 mg/ml cytochrome C: µg cit C µl cit C (0.01 mg/ml) µl k phosph 0.0 – 80 0.01 1 79 0.02 2 78 0.05 5 75 0.1 10 70 0.2 20 60 Proceed exactly as to the quantification of mosquito samples – Section 5.1, e – h. 5.3. alpha-Esterase (a-EST) The Table below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.3. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 alpha-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock 2 alpha-naphthyl acetate/Na phosphate 20 ml 25 ml freshly prepared 3 Fast Blue 10 ml 15 ml a) Distribute 10 µl of the homogenates, after centrifugation, in duplicate, in one mi- croplate. b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12) add 10 µl of water. Insecticide resistance mechanisms quantification | 41 5.3.1. curva-padrão de alfa-naftol Adicionar, em duplicata, na mesma linha de uma placa, as seguintes quantidades de alfa-naftol a 0,5 mg/ml: µg alfa-naftol µl alfa-naftol (0,5 mg/ml) µl H2O 0 – 10 1 2 8 2 4 6 3 6 4 4 8 2 5 10 – Proceder como para a dosagem nas amostras – Seção 5.3, d – h. 5.4. Esterase beta (b-EST) A tabela abaixo discrimina as soluções necessárias para este teste. Para consulta sobre os detalhes da preparação, consulte a Seção 6.4. a) Distribuir 10 µl de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, em uma placa. b) Em cada um dos poços correspondentes aos “brancos” (três poços: G10 a G12) adicionar 10 µl de água. c) Em cada um dos poços correspondentes aos controle positivos (três poços: H10 a H12), adicionar 10 µl de solução de beta-naftol a 0,5 µg/µl (~ 3,5 nmoles/µl) em cada poço (total: 5 µg ou ~35 nmoles). d) Adicionar, em cada poço, 200 µl de beta-naftil acetato/Na fosfato. e) Deixar 15 minutos à temperatura ambiente. f) Adicionar, em cada poço, 50 µl de Fast Blue. Como mencionado na seção anterior, esta solução é preparada em quantidade suficiente para a quantificação de alfa e beta-Esterases. Cuidado ao pipetar. (o volume final em cada poço é de 260 µl) n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 beta-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque 2 beta-naftil acetato/Na fosfato 20 ml 25 ml preparar antes do teste 3 Fast Blue 10 ml 15 ml Página ao lado: Coloração resultante do teste para b-EST. B: branco; C: controle positivo 44 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5.3.1. alpha-naphthol standard curve Add, in duplicate, in the same line of a microplate, the following quantities of 0.5 mg/ml alpha-naphthol: µg alpha-naphthol µl alpha-naphthol (0.5 mg/ml) µl H2O 0 – 10 1 2 8 2 4 6 3 6 4 4 8 2 5 10 – Proceed exactly as to the quantication of mosquito samples – Section 5.3, d – h. 5.4. beta-Esterase (-EST)  eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.4. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 beta-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock 2 beta-naphthyl acetate/Na phosphate 20 ml 25 ml freshly prepared 3 Fast Blue 10 ml 15 ml a) Distribute 10 µl of the homogenates, aer centrifugation, in duplicate, in one mi- croplate. b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12) add 10 µl of water. Resulting color of -EST assay. B: blank; C: positive control ROCK Insecticide resistance mechanisms quantification | 45 g) Esperar 5 minutos à temperatura ambiente. h) Fazer a leitura (end point), a 570 nm. 5.4.1. curva-padrão de beta-naftol Adicionar, em duplicata, na mesma linha de uma placa, as seguintes quantidades de beta-naftol a 0,5 mg/ml: µg beta-naftol µl beta-naftol (0,5 mg/ml) µl H2O 0 – 10 1 2 8 2 4 6 3 6 4 4 8 2 5 10 – Proceder como para a dosagem nas amostras – Seção 5.4, d – h. Adição dos reagentes nas placas para quantificação de a-EST e b-EST 46 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5.5. “PNPA” Esterase (PNPA-EST)  eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.5. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 PNPA/Na phosphate 20 ml 25 ml freshly prepared a) Distribute 10 µl of the homogenates, aer centrifugation, in duplicate, in one mi- croplate. b) In the “blank” wells (6 wells: G10 to G12 and H10 to H12), add 10 µl of water. c) Add to each well 200 µl of the working solution: PNPA/Na phosphate. (the nal volume in each well is 210 µl) d) Read the absorbance at 405 nm, at 15-seconds intervals, during 2 minutes. According to the WHO handbook (Hemingway 1998), this assay must not be read as “end point”. 5.6. Glutathione-S-transferase (GST)  eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.6. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml freshly prepared The GST assay is read with na UV filter (340nm) since its reaction product is not colored. Facing page: Resulting color of PNPA- EST assay. B: blank ROCK Insecticide resistance mechanisms quantification | 49 a) Distribuir 15 µl de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, em uma placa. b) Em cada um dos poços correspondentes aos “brancos” (seis poços: G10 a G12 e H10 a H12) adicionar 15 µl de água. c) Adicionar, em cada poço, 195 µl de solução de trabalho: GSH/CDNB. (o volume final em cada poço é de 210 µl) d) Fazer leitura, por 20 minutos, a intervalos de 1 minuto, a 340 nm. 5.7. Proteínas totais (PTN) A tabela abaixo discrimina as soluções necessárias para este teste. Para consulta sobre os detalhes da preparação, consulte a Seção 6.7. (**) deste total, parte é usada para a confecção da curva-padrão de BSA: 3,6 ml (Se- ção 5.7.1, alternativa 1) ou 7,2 ml (Seção 5.7.2, alternativa 2). a) Distribuir 10 µl de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, em uma placa. b) Em cada um dos poços correspondentes aos “brancos” (três poços: G10 a G12), adicionar 10 µl de água. c) Em cada um dos poços correspondentes aos controles positivos (três poços: H10 a H12), adicionar 10 µl de solução de BSA a 1 µg/µl (10 ug totais). d) Adicionar, em cada poço, 300 µl do reativo (Bio-Rad) a 1:5. (o volume final em cada poço é de 310 µl) e) Fazer leitura, 3 a 5 minutos após a adição de reativo, a 620 nm. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 BSA 1 µg/µl 30 µl 1 ml em estoque 2 reativo Bio-Rad 30 ml 40 ml (**) preparar antes do teste Adição do reativo para dosagem de proteína total nos homogenatos de mosquitos. Página ao lado: Coloração resultante do teste para PTN. B: branco; C: controle positivo 50 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas a) Distribute 15 µl of the homogenates, aer centrifugation, in duplicate, in one mi- croplate. b) In the “blank” wells (6 wells: G10 to G12 and H10 to H12) add 15 µl of water. c) Add to each well 195 µl of the working solution: GSH/CDNB. (the nal volume in each well is 210 µl) d) Read the absorbance at 340 nm, at one-minute intervals, during 20 minutes. 5.7. Total proteins (PTN)  eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re- lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.7. n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 1 µg/µl BSA 30 µl 1 ml in stock 2 Bio-Rad reactive 30 ml 40 ml (**) freshly prepared (**) part of this quantity is used in the BSA standard curve: 3.6 ml (Section 5.7.1, alternative 1) or 7.2 ml (Section 5.7.2, alternative 2). a) Distribute 10 µl of the homogenates, aer centrifugation, in duplicate, in one mi- croplate. b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12) add 10 µl of water. c) In the “positive control” wells (3 wells: H10 to H12), add 10 µl of 1 µg/µl BSA (total:10 ug). d) Add to each well 300 µl of the Bio-Rad reactive at 1:5. (the nal volume in each well is 310 µl) e) Read the absorbance 3 -5 minutes later, at 620 nm. Resulting color of PTN assay. B: blank; C: positive control. Facing page: Addition of protein reactive to quantify total proteins in mosquito homogenates ROCK Insecticide resistance mechanisms quantification | 51 5.7.2. curva-padrão de proteína – alternativa 2 Esta é a curva-padrão que pode ser utilizada nos casos em que houver necessidade de maior detalhamento dos valores. Adicionar, em duplicata, em duas linhas de uma placa, como indicado na Seção 5.7.3, as seguintes quantidades de BSA: µg BSA µl BSA (*) µl H2O 0 0,0 10 1 1,0 9 2 2,0 8 3 3,0 7 4 4,0 6 5 5,0 5 6 6,0 4 7 7,0 3 8 8,0 2 9 9,0 1 10 10,0 0 15 7,5 2,5 (*) Em todos os casos, utiliza-se solução-estoque de BSA a 1 µg/µl, com exceção do ponto de 15 µg, quando solução a 2 µg/µl é usada. Proceder como para a dosagem nas amostras – Seção 5.7, d, e. 5.7.3. posição das amostras de BSA para a curva-padrão Página ao lado: Coloração resultante das duas alternativas de curva-padrão de proteína 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0 0 2,5 2,5 5 5 7,5 7,5 10 10 15 15 B C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 D 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 E F G H 54 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5.7.3. distribution of BSA samples for the standard curve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0 0 2.5 2.5 5 5 7.5 7.5 10 10 15 15 B C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 D 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 E F G H Resulting color of both protein standard curve alternatives Insecticide resistance mechanisms quantification | 55 6. PREPARAÇÃO DE REAGENTES ESPECÍFICOS 6.1. Acetilcolinesterase (ACE) 1) Triton/Na fosf – 1% Triton X-100 em 100 mM tampão fosfato de sódio pH 7,8 Esta solução pode ser estocada por meses, fechada, a 4ºC. Estoque, 500 ml - 5 ml Triton X-100 a 100% - 50 ml tampão fosfato de sódio a 1 M pH 7,8 (para preparação consultar Seção 7.1.2) - água qsp 500 ml 2) DTNB/Na fosf – 10 mM DTNB em 100 mM tampão fosfato de sódio pH 7,0 Esta solução deve ser preparada no máximo 4 horas antes do uso. Solução de trabalho, 3 ml - 0,012 g (0,01189 g) de DTNB (PM 396,3)20 - 3 ml tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0 (para preparação consultar Seção 7.1.3) 3, 4) AchE/AchI – Iodeto de acetiltiocolina, a 10 mM, em água, na ausência (AchE) ou na presença (AchI) de propoxur Estas soluções devem ser preparadas no máximo 4 horas antes do uso. Para ter 3 ml de cada solução: Solução de trabalho, 6 ml - 0,0174 g de iodeto de acetiltiocolina (PM 289,2)21 - 6 ml água - separar 3 ml: AchE - aos 3 ml restantes, adicionar 6 µl de propoxur 0,1 M em acetona: AchI (para preparação de propoxur, consultar Seção 7.4) 0 Em geral, mantemos várias alíquotas de 0,012 g de DTNB em tubos Eppendorf, a 4ºC.  Em geral, mantemos várias alíquotas de 0,0174 g de acetiltiocolina em tubos Eppendorf, a -20ºC. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 Triton/Na fosf 29 ml 500 ml em estoque 2 DTNB/Na fosf 2 ml 3 ml preparar na hora3 AChE 2,5 ml 3 ml 4 AChI 2,5 ml 3 ml 56 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 6.2. Mixed Function Oxidases (MFO) n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 K phosph 6 ml 500 ml in stock 2 cytochrome C 60 µl 5 ml 3 TMBz/Na acet 20 ml 24 ml freshly prepared 4 3% H2O2 2.5 ml 3 ml 1) potassium phosphate buffer (k phosph) - 90 mM potassium phosphate buffer pH 7.2 This solution can be stored for several months, closed at 4ºC. Stock, 500 ml - details of preparation in Section 7.2.3 2) cytochrome C – 0.01 mg/ml in 250 mM sodium acetate pH 5.0 This solution is stored at -20ºC, in 80-100 µl aliquots. Each aliquot is used only once, and the remainder is discarded. Stock, 5 ml - weight 0.5 mg cytochrome C - add 5 ml 250 mM sodium acetate buffer pH 5.0 (Section 7.3). Final concentration: 0.1 mg/ml - dilute this solution to a tenth: 0.5 ml stock + 4.5 ml 250 mM sodium acetate pH 5.0 - this amount is enough for 50 aliquots of 100 µl each 3) TMBZ/sodium acetate (TMBZ/Na acet) This solution must be freshly prepared. working solution - 6 ml 0.2% TMBZ in methanol (a) - 18 ml 250 mM sodium acetate buffer pH 5.0 (b) This solution is prepared in two steps: a) 0.2% TMBZ in methanol (6 ml for each assay) Insecticide resistance mechanisms quantification | 59 Solução de trabalho - 0,012 g de TMBZ22 - 6 ml metanol Esta solução deve ser preparada no momento do uso. b) tampão acetato de sódio a 250 mM pH 5,0 Estoque - para detalhes de preparação, consultar Seção 7.3.1 4) peróxido de hidrogênio – H2O2 a 3% Esta solução deve ser preparada no momento do uso. Solução de trabalho - 300 µl H2O2 a 30% - 2,7 ml água 6.3. Esterase alfa (a-EST) 1) alfa-naftol – alfa-naftol a 0,5 mg/ml (~ 3,5 mmoles/ml) (PM: 144,2) Esta solução é estocada a -20ºC, em alíquotas de 100 µl. As alíquotas podem ser usa- das mais de uma vez. Estoque, 5 ml - pesar 2,5 mg de alfa-naftol - adicionar 5 ml de acetona - esta quantidade é suficiente para 50 alíquotas de 100 µl 2) alfa-naftil acetato/fosfato de sódio (alfa-naftil acet / Na fosf) – 0,3 mM alfa-naftil acetato em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,2 Esta solução deve ser preparada no máximo 1-2 horas antes do uso.  Em geral, mantemos várias alíquotas de 0,012 g de TMBZ em tubos tipo Eppendorf, a 4ºC. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 alfa-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque 2 alfa-naftil acet/Na fosf 20 ml 25 ml preparar na hora 3 Fast Blue 5 ml 15 ml 60 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas working solution - 0.012 g TMBZ22 - 6 ml methanol This solution must be freshly prepared. b) 250 mM sodium acetate buffer pH 5.0 Stock - details of preparation in Section 7.3.1 4) hydrogen peroxide – 3% H2O2 This solution must be freshly prepared. working solution - 300 µl 30% H2O2 - 2.7 ml water 6.3. alfa-Esterase (a-EST) n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 alpha-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock 2 alpha-naphthyl acet/Na phosph 20 ml 25 ml freshly prepared 3 Fast Blue 5 ml 15 ml 1) alpha-naphthol – 0.5 mg/ml alpha-naphthol (~ 3.5 mmoles/ml) (MW: 144.2) This solution is stored at -20ºC, in 100 µl aliquots. Aliquots may be used more than once. Stock, 5 ml - weigh 2.5 mg de alpha-naphthol - add 5 ml acetone - this amount is enough for 50 aliquots of 100 µl each 2) alpha-naphthyl acetate/sodium phosphate (alpha-naphthyl acet/Na phosph) – 0.3 mM alpha-naphthyl acetate in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 This solution must be prepared not more than 1-2 hours before use.  We keep several 0.012 g TMBZ aliquots in Eppendorf tubes, at 4ºC. Insecticide resistance mechanisms quantification | 61 2) beta-naftil acetato/fosfato de sódio (beta-naftil acet/Na fosf) – 0,3 mM beta-naftil acetato em tampão fosfato 20 mM pH 7,2 Esta solução deve ser preparada no máximo 1-2 horas antes do uso. Solução de trabalho - 250 µl 30 mM beta-naftil acetato (a) - 24,75 ml tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,2 (b) Esta solução é feita em duas etapas: a) 30 mM beta-naftil acetato em acetona Estoque - 0,028 g de beta-naftil acetato (PM 186,2) - 5 ml acetona Esta solução pode ser estocada por meses, fechada, a 4ºC. b) tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,2 - para preparação consultar Seção 7.1.4 3) Fast Blue – A preparação desta solução, em quantidade suficiente para os ensaios de alfa e beta-Esterases, está indicada na seção anterior. 6.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST) 1) acetato de para-nitrofenil/fosfato de sódio (PNPA/Na fosf) – 1 mM PNPA em tampão fosfato de sódio a 50 mM pH 7,4 Esta solução deve ser preparada imediatamente antes do uso (normalmente prepara- mos no máximo 5 minutos antes de usar). Se a solução estiver fortemente amarelada, descartar. Solução de trabalho: - 250 µl 100 mM PNPA em acetonitrila (a) - 24,75 ml tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,4 (b) n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 PNPA/Na fosf 20 ml 25 ml preparar na hora 64 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 2) beta-naphthyl acetate/sodium phosphate (beta- naphthyl acet/Na phos- ph) – 0.3 mM beta-naphthyl acetate in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 This solution must be prepared not more than 1-2 hours before use. working solution - 250 µl 30 mM beta-naphthyl acetate (a) - 24.75 ml 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 (b) This solution is prepared in two steps: a) 30 mM beta-naphthyl acetate in acetone Stock - 0.028 g beta-naphthyl acetate (MW 186.2) - 5 ml acetone This solution can be stored for several months, closed, at 4ºC. b) 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 - details of preparation in Section 7.1.4 3) Fast Blue – Preparation of this solution, in quantity enough to the alpha and beta- Esterases assays, in indicated in the previous section. 6.5. “PNPA” Esterase (PNPA-EST) n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 PNPA/Na phosph 20 ml 25 ml freshly prepared 1) p-nitrophenyl acetate/sodium phosphate (PNPA/Na phosph) – 1 mM PNPA in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 This solution must be prepared immediately before use (in general our preparation does not exceeded 5’ prior to usage). If the solution presents an intense yellow color, discard. working solution - 250 µl 100 mM PNPA in acetonitrile (a) - 24.75 ml 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 (b) Insecticide resistance mechanisms quantification | 65 Esta solução é feita em duas etapas: a) 100 mM PNPA em acetonitrila Solução de trabalho - 0,01815 g PNPA (PM 181,15)24 - 1 ml de acetonitrila25 De acordo com o manual da OMS (Hemingway 1998), esta solução pode ser estocada por 1-2 meses, fechada, a 4ºC. No laboratório, descartamos depois de uma semana. Acetonitrila é altamente tóxica. Cuidado! b) tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,4 Solução de trabalho - para preparação consultar Seção 7.1.3 6.6. Glutationa-S-transferase (GST) 1) glutationa reduzida/cloro-dinitrobenzeno (GSH/CDNB) – 9,5 mM GSH em 1 mM CDNB O manual da OMS (Hemingway 1998) preconiza que esta solução seja preparada 1 a 2 horas antes do uso. Nós preparamos, no máximo, 10-15 minutos antes. Solução de trabalho: - 20 ml de GSH a 10 mM (a) - 1 ml de CDNB a 21 mM (b) Esta solução é feita em duas etapas: a) 10 mM GSH (PM 307,3) em tampão fosfato de potássio  Esta solução é suficiente para quatro testes. A solução descrita no item (a) é mantida a 4ºC. Adicionalmente, podem-se manter várias alíquotas de 0,01815 g de PNPA em tubos tipo Eppendorf, a -20ºC.  Já experimentamos problemas em virtude da qualidade da acetonitrila; atualmente usamos o produto da Sigma, que tem funcionado adequadamente. n° solução quantidade por teste observações qto se gasta qto se prepara 1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml preparar na hora 66 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas working solution - 0.0615 g GSH26 - 20 ml 100 mM potassium phosphate buffer pH 6.5 (see Section 7.2.4) b) 21 mM CDNB (MW 202.6) in methanol working solution - 0.0042 g CDNB24 - 1 ml methanol 6.7. Total proteins (PTN) n° solution quantity per test observations quantity used quantity prepared 1 BSA (control) 30 µl 1 ml in stock 2 Bio-Rad reactive 30 ml 40 ml (**) freshly prepared 1) Bovine Serum Albumin (BSA) – 1 mg/ml in water Vials with 1 ml of the standard BSA solution, at 2 mg/ml (see Section 3.4.2) are kept at 4ºC. Once the vial is oppened, its content is distributed in 60-100 ul aliquots in 0.5 ml Eppendorf tubes, stored at -20ºC. Upon application, an equal volume of water is added to one aliquot (in order to pre- pare 1 mg/ml BSA). Each aliquot is enough for the positive controls (in the microplates containing the mos- quito samples) and for the standard curve, according to alternative 1 (60 µl aliquot) or alternative 2 (100 µl aliquot). The remaining 1 mg/ml BSA solution is discarded. In the standard curve, the point corresponding to 15 µg BSA (see Sections 5.7.1 and 5.7.2) is obtained directly with the solution at 2 mg/ml. For this purpose, we use a separate aliquot that is re-frozen 2-3 times. 2) protein reactive (Bio-Rad reactive) – Bio-Rad cat 500-0006 This solution must be prepared immediately prior to usage. working solution - 8 ml reactive - 32 ml water  We keep several 0.0615 g GSH and 0.0042g CDNB aliquots in Eppendorf tubes, at 4ºC. Insecticide resistance mechanisms quantification | 69 7. TAMPÕES GERAIS E SOlUÇÕES-ESTOQUE Todas as soluções descritas nas Seções 7.1 a 7.4 são estocadas a 4ºC. Observações importantes: 1) Fazer a solução-estoque de tampão no máximo 20 vezes mais concentrada que a solução de trabalho. 2) Para obter o pH adequado, devem-se misturar duas soluções de mesma molari- dade (monobásico e bibásico), nas quantidades indicadas. A solução resultante (o tampão) estará, automaticamente, na mesma molaridade que as soluções de fosfato originais. 3) Fazer a mistura no pHmetro. As quantidades indicadas abaixo são, na prática, apenas uma aproximação. - Adicionar mais fosfato bibásico se tiver que elevar o pH. - Adicionar mais fosfato monobásico se tiver que baixar o pH. 4) Atenção com contaminações. Guardar as soluções em frascos transparentes. Exa- minar sempre ao usar! 7.1. Tampões fosfato de sódio Tampões fosfato de sódio necessários: Preparação de estoques de tampão fosfato de sódio: 7.1.1. estoques fosfato de sódio (mono e bibásico) a 1 M - fosfato de sódio monobásico 1 M – 1 litro (PM = 120) (usamos fosfato anidro: NaH2PO4) 120 g de fosfato de sódio monobásico água qsp 1 litro Esterilize com filtro 0,22 µm - fosfato de sódio bibásico 1 M – 1 litro (PM = 142) (usamos fosfato anidro: Na2HPO4) 142 g de fosfato de sódio bibásico molaridade pH enzima, teste solução 100 mM 7,0 ACE DTNB/Na fosf 50 mM 7,4 PNPA-EST PNPA 100 mM 7,8 ACE Triton/Na fosf 20 mM 7,2 EST (alfa, beta) naftil acet/Na fosf 70 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 7. GENERAl BUFFERS AND STOCk SOlUTIONS All the solutions described in Sections 7.1 to 7.4 are stored at 4ºC. Important notes: 1) The buffer stock solution should be at most 20 times more concentrated than the working solution. 2) To obtain the required pH, two solutions of identical molarity (mono and bibasic) have to be mixed, in the indicated quantities. The resulting solution (buffer) will have, automatically, the same molarity than the original phosphate solution. 3) Mix both solutions in the pHmeter. The amounts indicated below are just an indi- cation. - Add more bibasic phosphate if you have to increase pH. - Add more monobasic phosphate if you have to decrease pH. 4) Take care with contaminations. Store your solutions in transparent flasks. Examine always before using!! 7.1. Sodium phosphate buffers Sodium phosphate buffers needed: molarity pH enzyme, test solution 100 mM 7.0 ACE DTNB/Na phosph 50 mM 7.4 PNPA-EST PNPA 100 mM 7.8 ACE Triton/Na phosph 20 mM 7.2 EST (alpha, beta) naphthyl acet/Na phosph Preparing stocks of sodium phosphate buffers: 7.1.1. sodium phosphate stocks (mono and bibasic) at 1 M - sodium phosphate monobasic 1M – 1 liter (MW = 120) (we use anhidrous phosphate: NaH2PO4) 120 g sodium phosphate monobasic water to 1 liter Sterilize by filtration through a 0.22 µm filter - sodium phosphate bibasic 1M – 1 liter (MW = 142) (we use anhidrous phosphate: Na2HPO4) 142 g sodium phosphate bibasic Insecticide resistance mechanisms quantification | 71 - fosfato bibásico: 40 ml fosfato + 160 ml água (200 ml final) (estas serão soluções de fosfato a 0,2 M) b) Preparar 250 ml de tampão a 0,2 M, usando as mesmas proporções indicadas na tabela da Seção 7.1.2, b: - 70 ml fosfato monobásico - 180 ml fosfato bibásico c) Corrigir o pH, conforme necessário, usando as soluções de fosfato de sódio mono ou bibásico a 0,2 M (ver item a). d) Descartar o excedente das soluções de fosfato mono e bibásico a 0,2 M (descritas no item a). e) Diluir o tampão a 0,2 M 10 vezes para preparar a solução a 20 mM: - 10 ml tampão fosfato 0,2 M pH 7,2 (ver item c) - 90 ml água - Este tampão pode ser diluído em quantidade suficiente para uso por 2-3 dias. - Dependendo do volume de trabalho, pode-se preparar 200 ml, adicionando-se 20 ml de tampão fosfato 0,2 M e 180 ml de água. 7.2. Tampões fosfato de potássio Tampões fosfato de potássio necessários: molaridade pH enzima, teste solução 90 mM 7,2 MFO K fosf 100 mM 6,5 GST GSH Preparação de estoques de tampão fosfato de sódio: 7.2.1. estoques fosfato de potássio (mono e bibásico) a 1M - fosfato de potássio monobásico 1 M – 1 litro (PM = 136,1) (usamos fosfato anidro: KH2PO4) 136,1 g de fosfato de potássio monobásico água qsp 1 litro Esterilize com filtro 0,22 µm - fosfato de potássio bibásico 1 M – 1 litro (PM = 228,2) (usamos fosfato trihidratado: K2HPO4.3H2O) 228,2 g de fosfato de potássio bibásico água qsp 1 litro Esterilize com filtro 0,22 µm 74 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas - bibasic phosphate: 40 ml phosphate + 160 ml water (200 ml final) (these will be 0.2 M phosphate solutions) b) Prepare 250 ml of 0.2 M buffer, using the same proportions indicated in the table of Section 7.1.2, b: - 70 ml monobasic phosphate - 180 ml bibasic phosphate c) Correct the pH, if necessary, using the 0.2 M mono or bibasic sodium phosphate solutions (see item a). d) Discard the remaining 0.2 M mono and bibasic phosphate solutions (described in item a). e) Dilute the 0.2 M buffer 10 times to prepare the 20 mM solution: - 10 ml 0.2 M phosphate buffer pH 7.2 (see item c) - 90 ml water - This buffer can be diluted in amounts sufficient for usage during 2-3 days. - Depending on the work volume, 200 ml can be prepared, mixing 20 ml 0.2 M phosphate buffer and 180 ml water. 7.2. Potassium phosphate buffers Potassium phosphate buffers needed: molarity pH enzyme, test solution 90 mM 7.2 MFO K phosph 100 mM 6.5 GST GSH Preparing stocks of potassium phosphate buffers: 7.2.1. potassium phosphate stocks (mono and bibasic) at 1M - potassium phosphate monobasic 1M – 1 liter (MW = 136.1) (we use anhidrous phosphate: KH2PO4) 136.1 g potassium phosphate monobasic water to 1 liter Sterilize by filtration through a 0.22 µm filter - potassium phosphate bibasic 1 M – 1 liter (MW = 228.2) (we use trihydrated phosphate: K2HPO4.3H2O) 228.2 g de potassium phosphate bibasic water to 1 liter Sterilize by filtration through a 0.22 µm filter Insecticide resistance mechanisms quantification | 75 7.2.2. tampões-estoque fosfato de potássio a 1 M a) Na tabela abaixo estão as quantidades recomendadas para a preparação de 1 litro dos tampões fosfato de potássio nos pHs necessários. É importante que a concen- tração seja a mesma nas duas soluções de fosfato: pH monobásico (kH2PO4) bibásico (k2HPO4) 6,5 640 ml 360 ml 7,2 283 ml 717 ml 7.2.3. tampão fosfato de potássio a 90 mM pH 7,2 a) preparação de tampão a 1 M - 71,7 ml de fosfato bibásico a 1 M - 28,3 ml de fosfato monobásico a 1 M - misturar no agitador magnético, com acompanhamento no pHmetro - corrigir o pH, se necessário, acrescentando fosfato bibásico para elevar o pH ou o fosfato monobásico para diminuir o pH - com isto, tem-se 100 ml de uma solução tampão fosfato de potássio a 1 M pH 7,2 b) preparação de tampão a 90 mM - 45 ml tampão fosfato de potássio a 1 M, pH 7,2 (ver item a) - 455 ml de água - conferir pH. Acertar com fosfato bibásico ou monobásico a 90 mM para manter a molaridade desejada27 7.2.4. tampão fosfato de potássio a 100 mM pH 6,5 a) preparação de tampão a 1 M - 18 ml de fosfato bibásico a 1 M - 32 ml de fosfato monobásico a 1 M - misturar no agitador magnético, com acompanhamento no pHmetro - corrigir, se necessário, acrescentando fosfato bibásico para elevar o pH ou o fos- fato monobásico para diminuir o pH - com isto, tem-se 50 ml de uma solução tampão fosfato de potássio a 1 M pH 6,5 b) preparação de tampão a 100 mM - 50 ml tampão fosfato de potássio a 1 M, pH 6,5 - 450 ml de água - conferir pH. Acertar com fosfato bibásico ou monobásico a 100 mM para man- ter a molaridade desejada28.  Para preparar fosfato de potássio mono ou bibásico a 90 mM basta adicionar 9 ml dos estoques a 1 M (Seção 7.2.1) a 91 ml de água.  Para preparar fosfato de potássio mono ou bibásico a 100 mM basta adicionar 10 ml dos estoques a 1 M (Seção 7.2.1) a 90 ml de água. 76 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 7.3. Sodium acetate buffer Sodium acetate buffer needed: molarity pH enzyme, test solution 250 mM 5.0 MFO TMBz/Na acet 7.3.1. sodium acetate buffer, stock at 250 mM pH 5.0 a) preparation of buffer at 3 M: - weigh 246.09 g sodium acetate, anhydrous (MW 82.03) - dissolve in 800 ml water - adjust pH to 5.0 with glacial acetic acid - add water up to 1 liter - Sterilize by filtration through a 0.22 µm filter b) preparation of buffer at 250 mM - 41.6 ml 3 M sodium acetate buffer - add water up to 450 ml - check pH again. Correct with glacial acetic acid - complete volume to 500 ml with water 7.4. Propoxur (Acethylcholinesterase assay) 0.1 M propoxur in acetone Stock, 1 ml: - 0.02092 g propoxur (MW: 209.24) - 1 ml acetone - prepare 100 µl aliquots and store at 4ºC (6 µl are used in each test) 7.5. SDS (alpha and beta-Esterases test) 5% SDS In the laboratory this solution is obtained by dilution of the 15% stock (50 ml 10% SDS and 50 ml water) Stock at 10%, 500 ml: - 50 g SDS (use mask when weighing!) - water up to 500 ml - dissolve with the aid of a magnetic stirrer, slowly (to avoid bubbles) - Sterilize by filtration through a 0.22 µm filter (also slowly) - store at room temperature (SDS precipitates if stored at 4ºC) Insecticide resistance mechanisms quantification | 79 8. COMPARAÇÃO PROTOCOlOS OMS – CDC – lAFICAVE MÉTODO OMS (homogenato 200ul) ENZIMA vol amost(µl) nº réplicas λ (Abs) t leitura (minutos) k X EP (*) ordem (**) EST alfa 20 1 570 15 EP não indicado EST beta 20 1 570 15 EP PNPA-EST 10 2 405 2 K GST 10 2 340 5 K/20 EP EP/K MFO 2 2 650 120 EP ACE 25 (x 2) 1 405 5 K/60 EP K/EP PTN 10 2 620 5 EP MÉTODO CDC (homogenato 2000ul) ENZIMA vol amost(µl) nº réplicas λ (Abs) t leitura (minutos) k X EP (*) ordem (**) EST alfa 100 3 540 20 EP 1 EST beta 100 3 540 20 EP 1 PNPA-EST este teste não é realizado GST 100 3 340 0 – 5 EP 4 MFO 100 3 620 10 EP 3 ACE 100 3 x 2 414 20 EP 2 PTN 20 3 620 0 EP 5 MÉTODO lAFICAVE (homogenato 300ul) ENZIMA vol amost(µl) nº réplicas λ (Abs) t leitura (minutos) k X EP (*) ordem (**) EST alfa 10 2 570 15 EP 4 EST beta 10 2 570 15 EP 3 PNPA-EST 10 2 405 2 K 5 GST 15 2 340 20 K 7 MFO 20 2 650 90 EP 1 ACE 25 (x 2) 2 405 60 EP 2 PTN 10 2 620 5 EP 6 (*) K: leitura cinética; EP: leitura end point (**) ordem de reação 80 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 8. COMPARING wHO – CDC – lAFICAVE PROTOCOlS wHO METHOD (200Ul HOMOGENATE) ENZYME sample vol (µl) nº replicate λ (Abs) t lecture (minutes) k X EP (*) order (**) EST alpha 20 1 570 15 EP not indicated EST beta 20 1 570 15 EP PNPA-EST 10 2 405 2 K GST 10 2 340 5 K/20 EP EP/K MFO 2 2 650 120 EP ACE 25 (x 2) 1 405 5 K/60 EP K/EP PTN 10 2 620 5 EP CDC METHOD (2000ul homogenate) ENZYME sample vol (µl) nº replicate λ (Abs) t lecture (minutes) k X EP (*) order (**) EST alpha 100 3 540 20 EP 1 EST beta 100 3 540 20 EP 1 PNPA-EST test not done GST 100 3 340 0 – 5 EP 4 MFO 100 3 620 10 EP 3 ACE 100 3 x 2 414 20 EP 2 PTN 20 3 620 0 EP 5 lAFICAVE METHOD (homogenate 300ul) ENZYME sample vol (µl) nº replicate λ (Abs) t lecture (minutes) k X EP (*) order (**) EST alpha 10 2 570 15 EP 4 EST beta 10 2 570 15 EP 3 PNPA-EST 10 2 405 2 K 5 GST 15 2 340 20 K 7 MFO 20 2 650 90 EP 1 ACE 25 (x 2) 2 405 60 EP 2 PTN 10 2 620 5 EP 6 (*) K: reading of absorbance as a rate, kinectic lecture; EP: “end point” reading of absorbance (**) reaction order Insecticide resistance mechanisms quantification | 81 9. ANÁlISE DOS RESUlTADOS Ao final de cada ensaio, obtém-se, como resultado, o valor de absorbância das répli- cas de cada mosquito. Para serem expressos em valores de atividade enzimática, estes dados precisam ser processados e corrigidos: 1) pelo volume de homogeneização do mosquito 2) pela quantidade de proteínas totais em cada mosquito 3) pela unidade de atividade de cada enzima considerada Nos próximos itens, estão indicadas as unidades usadas para representar os resulta- dos obtidos com cada enzima. As etapas necessárias para as conversões dos valores de absorbância em atividade enzimática de cada mosquito também estão brevemente discriminadas. 9.1. Acetilcolinesterase Os resultados de Acetilcolinesterase são expressos como o percentual de atividade enzimática remanescente após a adição do inibidor. Para isso calcula-se, para cada mosquito, a diferença entre os resultados de atividade obtidos na presença (placa AChI, Seção 5.1) e na ausência (placa AChE, Seção 5.1) do inibidor, propoxur: % atividade remanescente = AChI X 100 AChE Alternativamente, pode-se expressar o resultado como o percentual de inibição da Acetilcolinesterase: % inibição = (AChE-AChI) X 100 AChE Esta é a única enzima para a qual não é necessário corrigir os valores obtidos pelo total de proteínas nem pelo volume de homogeneização dos mosquitos. 9.2. Proteínas totais A dosagem do total de proteínas de cada mosquito é necessária para a correção de to- dos os valores de atividade das enzimas relacionadas com a resistência metabólica. Para calcular o total de proteínas de cada mosquito, os valores de absorbância obtidos nas alíquotas (10 µl) devem: 1) ser corrigidos para o volume total de homogenato (300 µl) - multiplicar a absor- bância por 30; 84 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 9. ANAlYSIS OF RESUlTS At the end of each assay the absorbance value of the replicates of each mosquito is obtained. In order to express these values as enzymatic activity the data must be pro- cessed and corrected according to: 1) the volume of mosquito homogenization 2) the amount of total proteins in each mosquito 3) the activity unit considered for each enzyme In the following items the units used to represent results with each enzyme are indi- cated. The steps needed to convert absorbance values in enzymatic activity for each mosquito are also briefly discriminated. 9.1. Acethylcholinesterase (ACE) Acethylcholinesterase results are expressed as the percentage of remaining activity after addition of the inhibitor. The difference between activity in the presence (plate AChI, Section 5.1) and absence (plate AChE, Section 5.1) of the inhibitor, propoxur, is calculated: % remaining activity = AChI X 100 AChE Alternatively the result can be expressed as the Acethylcholinesterase inhibition rate: % inhibition = (AChE-AChI) X 100 AChE In the case of ACE it is unnecessary to correct values according to the total quantity of proteins or to the homogenization volume of each mosquito. 9.2. Total proteins (PTN) Dosage of total proteins of each mosquito is a necessary step to correct activity values obtained for all enzymes related to metabolic resistance. To calculate total protein quantity in each mosquito, the absorbance values obtained in the 10 µl aliquots should: 1) be corrected by the total homogenate volume (300 µl) –absorbance multiplied by a factor of 30; 2) be transformed in µg protein. In order to do this, it is necessary to divide by the conversion factor. This factor is obtained with the standard curve (Sections 5.7.1 Insecticide resistance mechanisms quantification | 85 2) ser transformados em µg de proteína. Para isto é necessário dividir pelo fator de conversão. Este fator é obtido com a curva-padrão (Seções 5.7.1 e 5.7.2), a partir da qual se calcula a equação da reta (y = ax + b)29. O fator de conversão (a) é o coeficiente angular desta reta, que é obtido aplicando-se a fórmula: a = ∆y - b ∆x Onde: ∆y = diferença entre os valores de absorbância de dois pontos da reta ∆x = diferença entre os valores de proteína (BSA) dos pontos acima b = valor de absorbância na ausência de BSA (branco) 9.3. Oxidases de Função Mista Neste ensaio, mede-se o conteúdo de heme no inseto. Em mosquitos não alimentados com sangue, o heme está principalmente associado ao citocromo P450 (Hemingway 1998), do qual é o grupamento prostético. O citocromo P450 e seu grupamento pros- tético estão envolvidos em reações de monooxigenação, que catalisam a inserção de um átomo de oxigênio ao substrato, a partir de O2; o outro átomo de oxigênio é redu- zido à água. A equação geral para esta reação é: RH + O2 + 2H + + 2e→ ROH + H2O As enzimas citocromo P450 podem receber outras denominações, como Monooxi- genases citocromo P450, Oxidases de Função Mista (MFOs), Monooxigenases poli- substrato (PSMOs), heme thiolate proteins ou simplesmente P450 (Feyereisen 1999). Com o teste descrito na Seção 5.2 não é possível medir diretamente a atividade de monooxigenação da P450 sobre um substrato. Em vez disso, quantifica-se o conteúdo de heme presente no mosquito, o que permite inferir sobre a atividade da enzima. Assim, quanto mais elevado for o conteúdo de heme, maior deve ser a atividade da P450, e vice-versa. Vale ressaltar a necessidade de usar mosquitos não alimentados com sangue, para reduzir o número de moléculas de heme (como aquelas presentes na proteína hemoglobina) que possam interferir com os resultados. Neste ensaio também se faz uma curva-padrão (Seção 5.2.1), com citocromo (que contém heme). Esta curva-padrão permite converter em conteúdo de citocromo os valores de absorbância obtidos com os homogenatos de mosquitos. Os resultados deste ensaio são então representados em µg ou nmoles de citocromo por miligrama de proteína total dos mosquitos (µg cit/mg ptn ou nmoles cit/mg ptn). Para calcular a concentração de citocromo/mg de proteína, os valores de absorbância obtidos nas alíquotas (20 µl) devem: 1) ser corrigidos para o volume total de homogenato (300 µl) - multiplicar a absor- bância por 15;  Nesta equação y = absorbância, x = concentração de BSA da curva-padrão, em microgramas, b = absorbância na ausência de proteína (branco). 86 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 3) be corrected by the total protein content of each mosquito. It is then necessary to divide the value obtained above by the total protein content of the corresponding mosquito (that is described above, Section 9.2). 9.4. alpha and beta-Esterases (a and b-EST) Results obtained with these enzymes are represented as nmol/mg ptn/min. The ab- sorbance values obtained with 10 µl mosquito aliquots should: 1) be corrected by the total homogenate volume (300 µl) absorbance multiplied by a factor of 30; 2) be transformed in substrate nmols. In order to do this it is necessary to divide by the conversion factors. These factors are obtained with the alpha or beta-naphthol standard curves (Sections 5.3.1 and 5.4.1). Calculations are done exactly as de- scribed in Section 9.2; 3) be corrected by total proteins. Each value obtained above is divided by the total protein content of the corresponding mosquito, detailed in Section 9.2. The result is the amount of substrate (in nmol) consumed by protein mg of each mosquito in the total reaction time (15 minutes); 4) to calculate the enzyme activity per minute, it is sufficient to divide the value ob- tained above by 15. 9.5. “PNPA” Esterase (PNPA-EST) In opposition to alpha- and beta-Esterases, for this assay (Section 5.6) a standard substrate is not available. For this reason it is neither possible to construct a stand- ard curve nor to convert absorbance values in consumed substrate amount. In this assay the final result is expressed as ∆Abs/mg ptn/min, meaning that the absorb- ance variation in one minute is calculated, being corrected by the total protein con- tent in each mosquito. In practice the unit that is considered is the rate of reaction (expressed as ∆Abs/min). The procedure we adopt with the absorbance values obtained in the 10 µl aliquots is as follows: 1) for each mosquito a graph "absorbance X minute" is constructed. With these graphs, the linear equation is calculated, and a correlation index (R2) is obtained. This index, which varies from 0 to 1, evaluates the correlation between the ob- served and expected values; 2) all mosquitoes that have R2 values lower than 0.9 are discarded; 3) the absorbance difference from 90 to 30 seconds is calculated. This corresponds to the one minute sample variation of reaction (60”); 4) to obtain the ∆Abs/min for each mosquito, the value obtained above is multiplied by 30 (the dilution factor); Insecticide resistance mechanisms quantification | 89 5) faz-se a correção pelas proteínas totais. Para isso, divide-se cada valor obtido aci- ma pelo total de proteínas do mosquito correspondente, em miligramas. 9.6. Glutationa-S-transferase (GST) Assim como para a Esterase “PNPA”, para este ensaio (Seção 5.6) não se usa um subs- trato padrão e, portanto, não é possível construir uma curva-padrão. Por outro lado, neste caso pode-se calcular a quantidade de substrato utilizado na reação. Para isso, os parâmetros utilizados por Hemingway (1998) foram considerados e incorporados aos cálculos. Estes parâmetros incluem: - os valores do coeficiente de extinção do produto desta reação, a (3-(2-cloro-4-ni- trofenil)-glutationa; - o caminho óptico do espectrofotômetro, ou seja, a altura da solução nos poços das microplacas (em nosso caso, 0,6 cm). Estes parâmetros são usados para transformar valores de absorbância (Abs) em mmoles/mosquito/minuto, de acordo com a fórmula: mmol/mosq/min = (Abs20-Abs10) X 20 4,39 X 0,6 X 10 Onde: Abs20 = o valor de Abs obtido no tempo de leitura de 20 minutos Abs10 = o valor de Abs obtido no tempo de leitura de 10 minutos 30 20 no numerador = fator de diluição (15 µl de amostra, de um total de 300 µl) 10 no denominador = minutos de reação (diferença entre 20 e 10 minutos) 4,39 = coeficiente de extinção do produto da reação 0,6 = caminho óptico (= altura da solução no poço, em cm) Ou seja, simplificando: mmol/mosq/min = (Abs20-Abs10) X 2 4,39 X 0,6 Para corrigir pelas proteínas totais, divide-se o valor gerado acima pelo total de pro- teína do mosquito correspondente, cuja obtenção está descrita na Seção 9.2. Com a correção da atividade por mg de proteína, o resultado final deste ensaio é expresso em mmoles/mg ptn/min, que corresponde à quantidade, em mmoles, do produto de reação gerado por minuto, por mg de proteína. 0 Em nossa experiência, há muita oscilação nos valores medidos até 10 minutos de reação. Por isso, só estamos consideran- do o intervalo entre 10 e 20 minutos. 90 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 5) the correction by total proteins is then performed. Each value obtained above is divided by the total protein content of the corresponding mosquito, in milligrams. 9.6. Glutathione-S-transferase (GST) Similarly to “PNPA” Esterase, for this assay (Section 5.6) a standard substrate is not available. For this reason it is not possible to construct a standard curve. However, in this case it is possible to calculate the amount of substrate used in the reaction. The parameters utilized by Hemingway (1998) have been considered and were incorpo- rated in the calculations. These parameters include: – the extinction coefficient value of the reaction product, (3-(2-chloro-4-nitrophe- nyl)-glutathione; – the spectrophotometer path length, that corresponds to the height of the solution in the microplate well (in our case, 0.6 cm). These parameters are used to transform absorbance values (Abs) in mmoles/mos- quito/minute, according to the formula: mmol/mosq/min = (Abs20-Abs10) X 20 4.39 X 0.6 X 10 Where: Abs20 = Abs value obtained after 20 minutes of reaction Abs10 = Abs value obtained after 10 minutes of reaction 30 20 in the dividend = dilution factor (15 µl sample, from 300 µl homogenate) 10 in the divisor = minutes of reaction 4.39 = extinction coefficient of the reaction product 0.6 = path length (= height of the solution in the microplate well, in cm) Simplifying: mmol/mosq/min = (Abs20-Abs10) X 2 4.39 X 0.6 In order to correct by total proteins, the value above is divided by the total protein content of the corresponding mosquito, obtained as described in Section 9.2. After correction by protein mg, the final result of this assay is expressed as mmols/mg ptn/ min, corresponding to the amount, in mmols, of the reaction product generated per minute, per protein mg. 0 In our experience, a high oscillation is observed in the values measured up to 10 minutes of reaction. For this reason we consider only the interval between 10 and 20 minutes. Insecticide resistance mechanisms quantification | 91 10.1. Arquivo 1 – transferência dos dados do Soft Max para Excel O espectrofotômetro que utilizamos no laboratório está associado ao programa Soft Max, que fornece os valores de absorbância de cada posição da microplaca. Por outro lado, como mencionado, os arquivos para processamento dos dados foram elabora- dos no programa Excel. Quando se tenta transferir diretamente os dados de um programa para outro, os va- lores de absorbância vêm acompanhados de outros parâmetros, como temperatura e tempo de execução do teste, que não são necessários para o processamento dos da- dos. Esses dados “excedentes” devem ser excluídos para que restem apenas os valores de absorbância. O Arquivo 1 tem como objetivo principal preparar os dados originais de tal forma que apenas os valores de absorbância sejam mantidos. Com isso a transferência dos dados para outros arquivos fica facilitada. Desta forma também se pode trabalhar em outros computadores que não tenham o programa Soft Max instalado. O Arquivo 1 é composto por seis planilhas: a primeira com instruções de uso e cada uma das demais destinada aos dados de todas as enzimas de um teste completo. Estas planilhas são denominadas “data1” a “data5” e devem ser renomeadas com a data de realização do teste que lá será inserido. Em cada planilha existem espaços destinados aos dados brutos de absorbância de todas as enzimas, da quantificação de proteínas totais e da curva-padrão de proteí- nas (BSA). Estes espaços, que estão coloridos de azul, simulam as microplacas de 96 poços, seguindo a numeração e a distribuição dos mosquitos previamente definidas: mosquitos 1 a 40 correspondem à população sob teste e mosquitos 41 a 45 correspon- dem à cepa referência de susceptibilidade, como descrito na Seção 4.3.2. Como usar o Arquivo 1: 1) de acordo com a planilha “instruções” do Arquivo 1, salvar como o arquivo, com a expressão “dados originais” seguida do nome e da localização da população ava- liada e do ano de coleta do material analisado; 2) renomear cada planilha “data” com a data de realização de um teste completo: mês, dia e ano; 3) copiar do programa Soft Max os dados brutos (fornecidos pelo espectrofotôme- tro) e colar em espaços em branco de cada planilha. Selecionam-se então apenas as células que contêm os valores de absorbância. Estes valores são transferidos para os espaços coloridos de azul, destinados aos dados brutos de absorbância para cada enzima. A partir de agora, os dados inseridos nas planilhas do Arquivo 1 serão usados para 94 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas 10.1. File 1 – data transfer from Soft Max to Excel The spectrophotometer we use in the laboratory is associated with the Soft Max program that shows the absorbance value for each microplate position. However, as mentioned above, the files for data processing were elaborated in the Excel program. When data are transferred directly from Soft Max to Excel, the absorbance values are accompanied by other parameters, such as temperature and reading time, which are not necessary for the processing steps. These “excess” data should be eliminated, and only absorbance data should be retained. The principal purpose of File 1 is to prepare original data in such a way only the ab- sorbance values are maintained. This procedure facilitates transference of data to the other files. By doing this it is also possible to work in other computers, where Soft Max is not installed. File 1 contains six sheets. The first one presents filling out instructions; each of the remaining sheets was designed to receive data from all the enzymes of a complete test. These sheets are referred to as “date1” to “date5” and should be renamed with the date of the assay that will be inserted. Each sheet has cells assigned to receive the original absorbance values from all the en- zymes, from the quantification of total proteins and from the protein standard curve (BSA). These cells, that are blue-labeled and simulate the 96-well microplates, follow the numbering and distribution of the mosquitoes previously defined: mosquitoes 1 to 40 correspond to the population under test, and mosquitoes 41 to 45 belong to the susceptible reference strain, as described in Section 4.3.2. How to use File 1: 1) according to the sheet “instructions” of File 1, save as the file, with the expression “original data”, followed by the name and localization of the analyzed population and the year of collection of specimens; 2) rename each sheet “date” with the date of the test: month, day, year; 3) copy the original data (provided by the spectrophotometer) from the Soft Max program and paste in blank cells on the sheet. Then select only cells containing the absorbance values. These values are transferred to the blue-labeled cells, des- ignated to receive the absorbance values for each enzyme. Henceforth, data inserted in File 1 sheets will be used to fill out the following files (Files 2 to 4). These files contain calculations to convert the absorbance val- ues in enzymatic activity (Files 2 and 3) and to pool all the tests from the same population (File 4). Insecticide resistance mechanisms quantification | 95 preencher os próximos arquivos (Arquivos 2 a 4), que contêm os cálculos para a conversão dos valores de absorbância em atividade enzimática (Arquivos 2 e 3) e para o agrupamento de todos os testes de uma mesma população (Arquivo 4). 96 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas