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Alexandra A. C. Nascimento

Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Paçó Larson

Nádia Monesi

Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues

Revisão 1: Eliana Valéria Patussi Márcia A. S. Graminha

Revisão 2: Fábio Márcio Squina

Josane de Freitas Sousa

Roberto Ruller Valeria Valente

I. CONCEITOS BÁSICOS 1. Introdução Até a década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analisada através de meios indiretos como a sequência de proteínas e análise genética. A partir da década de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de clonagem gênica. Na verdade, muitas destas técnicas são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se então, a molécula mais fácil de ser analisada, sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua seqüência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia. A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável. Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA. 2. Conceito de clonagem molecular A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante. 3. Enzimas de Restrição Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu próprio DNA desta degradação “camuflando-o” através da metilação de algumas bases específicas (modificação). Como conseqüência, este sistema é frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de bactérias. As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo I, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, são proteinas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta (Figura 1).

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.

a) Clivagem no eixo de simetria

Moléculas com extremidades abruptasMoléculas com extremidades coesivas b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria

Estas enzimas reconhecem seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqüências estão mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que a Hind I é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d I. A Tabela 1 mostra a seqüência palindrômica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrição. Note que algumas enzimas deixam terminações coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou não coesivos.

Tabela 1. Algumas endonucleases de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina. O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas. Uma importante conseqüência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada

Microrganismo Enzima Sequência Alvo EcoRIEscherichia coli

Bacillus amyloliquefaciens H

Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius

Haemophilus aegyptius

Providencia stuartii

Streptococcus albus G Thermus aquaticus

Serratia marcescens Brevibacterium albidium

Bacillus globigii

BamHI BglII

PstI

BalI

SmaI HaeIII

TaqI SalI

HindIII HaeII

P G C G C Pi

Pi C G C G Pu yu uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos (4=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta média pode sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8pb, incluindo nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos. A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Figura 2. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com brometo de etídio, uma molécula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. Construção do DNA Recombinante Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente.

Sentido da migração

Pares de base

A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmídeo.

Figura 3. Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.

A figura 3 mostra uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente, antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico). 5. DNA ligase Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator. Figura 4. DNA ligase cataliza a junção de duas fitas de DNA que são partes da molécula da dupla-hélice.

5.1. Tipos de fragmentos de DNA que são ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas As extremidades coesivas produzidas por várias enzimas de restrição permitem que dois fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples das extremidades coesivas das duas diferentes moléculas, através da formação de pontes de hidrogênio pela complementariedade das bases. Finalmente, a ligação covalente (fosfodiéster) dos fragmentos é realizada pela DNA ligase (ver figura 4).

Plasmídeo de E.coli

DNA humano

DNA ligase Plasmídeo híbrido

GCAT
TACG
TGCATGCA
ACGTACGT

Enzima Enzima TGCAACGT

TGCATGCAACGT ACGT

DNA DNA3’ OH O O 5’P O

DNA DNA3’ O O 5’O PO

DNA-Ligase ATP ou NAD b) Fragmentos com extremidade não coesivas DNAs portando extremidades não coesivas são ligados com muito menos eficiência que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentração muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos é necessária para que as moléculas com extremidades não coesivas sofram reação de ligação. No entanto, a ligação deste tipo de fragmento é facilitada pela transformação prévia das extremidades não coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito através de dois processos: a) Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, através da enzima desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotídeos à extremidade 3’-OH de fragmentos fita simples proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molécula é tratada previamente com uma exonuclease 5’-específica para remover alguns nucleotídeos terminais. Após a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e anelamento dos mesmos, as moléculas são unidas preenchendo-se os espaços existentes com o auxílio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adição de adaptadores às extremidades não coesivas. Os adaptadores são oligonucleotídeos sintéticos que contém sítios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrição. Eles são unidos ao DNA com o auxílio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade não coesiva, pode-se optar pela utilização de T4 ligase em grande concentração, o que permitirá a ligação entre moléculas de DNA sem proeminências. 6. Transformação bacteriana

6.1.Conceito de transformação induzida O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformação com DNA exógeno, quando a bactéria foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um curto choque térmico à 42oC. Estes mesmos autores também verificaram que as bactérias crescidas até a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento.

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T). 5

3’ 5’ - Exonuclease específica

Deoxinucleotídio transferase terminal

Espaços preenchidos com DNA Pol I. DNA ligase para completar a ligação

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