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Guias e Dicas
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Dna recombinante, Notas de estudo de Biologia Celular e Molecular

Tecnologia do dna recombinante

Tipologia: Notas de estudo

2010

Compartilhado em 06/05/2010

prof-esp-milton-cruz-7
prof-esp-milton-cruz-7 🇧🇷

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Baixe Dna recombinante e outras Notas de estudo em PDF para Biologia Celular e Molecular, somente na Docsity! UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO ♦TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ♦ Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Paçó Larson Nádia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues Revisão 1: Eliana Valéria Patussi Márcia A. S. Graminha Revisão 2: Fábio Márcio Squina Josane de Freitas Sousa Roberto Ruller Valeria Valente •2003 • uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos (44=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta média pode sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8pb, incluindo nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos. A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2). Figura 2. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com brometo de etídio, uma molécula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta. 4. Construção do DNA Recombinante Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente. 3 Sentido da migração Pares de base A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmídeo. Figura 3. Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição. A figura 3 mostra uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente, antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico). 5. DNA ligase Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator. Figura 4. DNA ligase cataliza a junção de duas fitas de DNA que são partes da molécula da dupla-hélice. 5.1. Tipos de fragmentos de DNA que são ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas As extremidades coesivas produzidas por várias enzimas de restrição permitem que dois fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples das extremidades coesivas das duas diferentes moléculas, através da formação de pontes de hidrogênio pela complementariedade das bases. Finalmente, a ligação covalente (fosfodiéster) dos fragmentos é realizada pela DNA ligase (ver figura 4). 4 Plasmídeo de E.coli DNA humano DNA ligase Plasmídeo híbrido Enzima Enzima GCA T T ACG TGCA TGCA ACGT ACGT TGCA ACGT TG CA TGCA AC GT ACGT DNA DNA3’ OH -O O 5’P O -O DNA DNA3’ O O 5’ O P -O + DNA-Ligase ATP ou NAD b) Fragmentos com extremidade não coesivas DNAs portando extremidades não coesivas são ligados com muito menos eficiência que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentração muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos é necessária para que as moléculas com extremidades não coesivas sofram reação de ligação. No entanto, a ligação deste tipo de fragmento é facilitada pela transformação prévia das extremidades não coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito através de dois processos: a) Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, através da enzima desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotídeos à extremidade 3’-OH de fragmentos fita simples proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molécula é tratada previamente com uma exonuclease 5’-específica para remover alguns nucleotídeos terminais. Após a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e anelamento dos mesmos, as moléculas são unidas preenchendo-se os espaços existentes com o auxílio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adição de adaptadores às extremidades não coesivas. Os adaptadores são oligonucleotídeos sintéticos que contém sítios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrição. Eles são unidos ao DNA com o auxílio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade não coesiva, pode-se optar pela utilização de T4 ligase em grande concentração, o que permitirá a ligação entre moléculas de DNA sem proeminências. 6. Transformação bacteriana 6.1.Conceito de transformação induzida O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformação com DNA exógeno, quando a bactéria foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um curto choque térmico à 42oC. Estes mesmos autores também verificaram que as bactérias crescidas até a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento. Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T). 5 5’ 5’ 5’ 5’3’ 3’ AAAA TTTT 3’ 3’ 3’ AAAA TTTT 3’ 3’ 3’ 5’ - Exonuclease específica Deoxinucleotídio transferase terminal Espaços preenchidos com DNA Pol I. DNA ligase para completar a ligação +dATP +dTTP Figura 8. Estrutura molecular de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular. Estão representados o gene de resistência (AmpR), a região de múltiplos sítios de clonagem (MSC) e a origem de replicação (O). Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular é o uso de enzima de restrição que produz extremidades compatíveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico. 2. FAGOS Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular é o denominado bacteriófago λ, o qual comporta- se como um vírus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veículo de clonagem molecular, vamos mostrar resumidamente as suas propriedades biológicas e estruturais. 2.1 Biologia do fago λ O fago λ é um parasita obrigatório da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação. Após a infecção da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias: a) No primeiro caso denominado estado lítico, o DNA do fago permanece na bactéria como uma molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago e a concomitante inativação de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o cromossomo do fago é replicado ativamente, ocorre a síntese das proteínas da capa e da cauda e formam-se novas partículas virais. Em aproximadamente 45 minutos após a infecção a célula hospedeira é lisada havendo a liberação de cerca de 100 novos fagos. b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir é o denominado estado lisogênico. Neste caso, o DNA do fago é integrado no cromossomo da bactéria passando a ser chamado profago. No estado lisogênico, todos os genes do profago estão inativos com excessão do gene que produz a proteína repressora. A bactéria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este é replicado passivamente e distribuído para as bactérias descendentes. Em condições naturais a opção entre seguir o estado lítico ou lisogênico depende das condições do meio. Assim, via de regra, em meio rico em nutrientes o estado lítico é preferencial, por exemplo o fago λ na bactéria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como é o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisogênico. Em condições experimentais, o estado a ser seguido depende de um balanço entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genéticos da bactéria hospedeira e do bacteriófago. 2.2 Genoma do fago λ O bacteriófago λ é uma partícula viral constituída de aproximadamente 50% de proteínas e 50% de DNA. O DNA do fago λ, na forma como ele é isolado da partícula viral, é uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molécula contêm uma fração de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotídeos, os quais são complementares na sequência de bases e através delas é que o DNA assume a forma circular quando ele é injetado na célula hospedeira. Estas extremidades são denominadas de sítios cos. O genoma do fago λ codifica para aproximadamente 50 proteínas, cujos genes tem um cronograma de expressão bem definido, o que determina a instalação do estado lítico ou lisogênico. As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biológico do fago λ em uma célula hospedeira e o genoma do fago λ com alguns dos seus principais genes, respectivamente. 2.3 Controle de expressão dos genes do fago λ Seja qual for a via a ser seguida pelo fago λ, ou seja via lítica ou lisogênica, a expressão dos genes envolvidos nestes circuitos começa pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados à esquerda (pL) e à direita (pR) do gene cI. Durante o transcurso da via lítica, o produto do gene cro está diretamente relacionado com a replicação do genoma do fago λ, através da indução da expressão dos genes OP. Por outro lado, o produto do gene N está diretamente relacionado com a expressão dos genes da região de empacotamento, ou seja genes A e J, responsáveis pela síntese das 8 AmpR O MSC proteínas da cabeça e da cauda do fago λ, como também da expressão dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da célula hospedeira. Figura 9. Replicação do fago λ no interior da célula hospedeira. Após adsorção (1) e injeção (2) do genoma do fago λ na bactéria, a via lítica indicada pelos números 3, 4 e 5 leva a formação de novas partículas virais. Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada levando à integração do material genético viral ao genoma da bactéria hospedeira. Figura 10. Representação esquemática do genoma do fago λ. Durante a via lisogênica, a transcrição também inicia-se pelos promotores pL e pR coordenando a expressão dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a expressão do gene cI que produz uma proteína repressora inibindo a expressão dos genes responsáveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante é o int, cujo produto relaciona-se com a integração do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisogênico. 2.4 O uso do fago λ como vetor de clonagem molecular Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos no processo de lisogênia são dispensáveis e consequentemente a região de integração do genoma do fago pode ser totalmente substituída por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alteração nos processos envolvidos na via lítica. Uma das maiores vantagens de usar o fago λ como vetor de clonagem é que o DNA inserido no fago é empacotado in vitro. Embora a eficiência de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos são empacotados teremos 100% de eficiência na infecção da E.coli hospedeira. Este processo é altamente eficiente quando comparado com o da transformação bacteriana com plasmídeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por µg de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são incorporados na E.coli hospedeira. Atualmente, existem vários derivados do fago λ nos quais um ou mais sítios de restrição flanqueiam a região de recombinação, facilitando a sua substituição por um outro DNA. Estes são os chamados vetores de substituição. Um exemplo típico destes vetores é o EMBL3, no qual a região de recombinação é flanqueada pelas enzimas de restrição EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo. Outros derivados do fago λ são os chamados vetores de inserção. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que 9 1 2 6 34 5 Empacotamento Recombinação Regulação Replicação Lise cos A J N Cro pL pr .cIII cI cII O P S Rint podem ser inseridos devem ter no máximo até 7kb de tamanho para não alterar os processos de empacotamento do genoma do fago. Os vetores de inserção derivados do fago λ mais bem utilizados especialmente na clonagem de cDNA, são os vetores λgt10 e o λgt11. Vamos a seguir fazer algumas considerações sobre estes dois tipos de vetores. No fago λgt10, o inserto geralmente cDNA, é inserido no sítio da EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante terá agora o gene cI obstruído e consequentemente durante a cultura provocará a lise das colônias de bactérias transformadas. Essas colônias lisadas são visualizadas como círculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos das colônias não recombinantes, que por possuírem o gene cI íntegro não são lisadas e permanecem como colônias turvas. Figura 11. Representação esquemática da clonagem de um fragmento de DNA genômico no fago λ. As regiões indicadas por a contém todas as informações necessárias para replicação em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digestão do DNA de interesse com enzima apropriada estão indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento. Por outro lado, o fago λgt11 contêm um sítio de restrição EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotídeos do códon de término da enzima codificada por esse gene (β-galactosidase). Essa enzima, cuja expressão pode ser induzida por IPTG (isopropil-β-D-galactosídeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colônias de bactérias carregando o DNA do fago com o gene LacZ intacto (sem inserto), na presença do indutor IPTG e do substrato X-gal, ficarão azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no sítio de EcoRI, não expressam a β-galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificação 10 EcoRI EcoRI ligase empacotamento in vitro a a b b b b c DNA bacteriófago DNA camundongo bacteriófago contendo genes do camundongo informações desnecessárias ã replicação c Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituição da região tardia 4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituição da região precoce Quando a clonagem no SV40 é feita na região precoce, a produção de partículas virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das proteínas codificadas pela região precoce (antígeno T). Para evitar uma infecção mista com um vírus SV40 deletado, usa-se uma linhagem celular, as células COS as quais, apresentam uma porção do genoma do SV40 integrado ao seu próprio cromossomo. Esta linhagem celular produz a proteína viral denominada antígeno T, a qual liga- se na origem de replicação do vírus e induz a sua replicação. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expressão em muitas estratégias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas é que o gene a ser clonado não pode ser grande, a outra é que as células hospedeira só podem ser células de macacos e finalmente, o genoma da célula hospedeira pode sofrer rearranjados ou deleções. Atualmente, dois outros sistemas virais mais versáteis estão em uso, são eles o vírus da vacina e o Baculovírus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais é que ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado só pode ser inserido por processos de recombinação dentro das células, o qual é bastante lento em relação aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante. Finalmente, um sistema viral bastante promissor são os retrovírus que são vírus cujo material genético é o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que são ciclos líticos. Os retrovírus infectam uma grande variedade de células de mamíferos e o seu RNA é transcrito reversamente para DNA o qual é incorporado ao genoma da célula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partículas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovírus são atualmente os vetores eleitos para uso em 13 SV40 gene cotransfecção partículas Virais SV40 Região funcional tardia Região funcional precoce O da globina SV40-globina empacotamento e lise terapia gênica. 5. BACTERIÓFAGO M13 O bacteriófago M13 é um fago filamentoso da E. coli e contém uma única fita de DNA envolvida por proteínas virais. Durante o seu ciclo, a célula hospedeira é infectada pela fita (+) a qual servirá como molde para a síntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da célula hospedeira e é amplificada até 200 cópias por célula, quando então a fita negativa não mais se replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as proteínas da cápsula viral e sai da célula hospedeira através de processo não lítico (Figura 16). Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituição da região precoce. Figura 16. Replicação do bacteriofago M13. 5.1. Clonagem no bacteriófago M13 A grande utilidade deste sistema de clonagem é a sua facilidade na produção de DNA fita simples, facilmente recuperável do sobrenadante de uma cultura líquida da E.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples é bastante útil no processo de sequenciamento do DNA pelo método desenvolvido por Sanger e colaboradores (1977). Para facilitar o seu uso especialmente em estratégias de seqüenciamento, foram desenvolvidos vetores da série M13mp, os quais contém o MSC inserido no gene que expressa a β-galactosidase. Mutações foram realizadas de tal modo que a enzima só é ativa quando o vetor está na célula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de alfacomplementação. A inclusão do múltiplo sítio de 14 SV40 gene Partícula Viral O da Região funcional tardia Região funcional precoce SV40-Ha hemaglutinina (Ha) co-transfecção SV40 mutante empacotamento e lise SV40 mutante integrado ao genoma da célula COS antígeno T replicação ++ ++ + - M13 E.coli clonagem no gene da β galactosidade visa a identificação dos possíveis recombinantes quando na presença de um substrato cromogênico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil-β-D-galactosídeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor está intacto (não recombinante), a enzima é funcional e frente ao substrato cromogênico este é clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando um fragmento de DNA é inserido no múltiplo sitio de clonagem, a expressão da enzima é suprimida, portanto as células são incapazes de metabolizar o substrato cromogênico formando placas incolores. 5.2. Estratégia de clonagem em vetores da série M13mp A utilização de vetores com diferentes orientações do múltiplo sítio de clonagem, tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a inserção de um fragmento de DNA em ambas as orientações. Como veremos adiante, esta estratégia apresenta grande aplicação no programa de sequenciamento de um DNA pelo método de Sanger. A figura 17 ilustra a inserção de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a inserção do fragmento de DNA na orientação 5'→3' no vetor M13mp8 e na orientação 3'→5' no vetor M13mp9. Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P). 6. FAGoMÍDEOS Apesar do bacteriófago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos processos de seqüenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras gerações de fagos, os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmídeo. Os primeiros foram os vetores da série pEMBL e mais tarde os plasmídeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores são chamados de fasmídeos ou fagomídeos e apresentam as seguintes características principais: fagomídeo apresenta um versátil MSC, permitindo a clonagem de grandes insertos sem maiores dificuldades, além de que, as enzimas situadas neste sítio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o processo de sequenciamento. utilizando uma combinação estratégica de duas enzimas de restrição, é possível criar terminações 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptível à ação da Exonuclease III. Esta estratégia, permite a obtenção progressiva e controlada de vários fragmentos deletados do inserto, os quais após a recircularização tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqüenciamento de um grande inserto de DNA, sem a necessidade de múltiplas subclonagens como é usual no sistema M13 ou a síntese de vários oligonucleotídeos internos, usados como iniciadores no processo de seqüenciamento. 6.1. Clonagem no fagomídeo Vamos utilizar como exemplo, o fagemídeo λZAP que é particularmente útil para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomídeo denominado pBluescript. Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma proteína de fusão quando na orientação correta, podendo assim também ser rastreada com anticorpos. Quando uma cepa da E.coli (F') é infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as proteínas do sistema M13. Essas proteínas reconhecem os sinais de iniciação e término da síntese de DNA do fago auxilar (f1) que estão flanqueando o pBluescript, que por sua vez está incorporado no fago λZAP e carrega o inserto. 15 P 5’ 3’ P E EP E E P PE M13 mp9 M13 mp8 objetivo é o isolamento de genes presentes em uma única cópia num genoma complexo, ou quando o objetivo é o isolamento de clones portadores do DNA complementar à RNA mensageiro raro. Deste modo, é claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) é necessário à obtenção de coleções de clones recombinantes, portadores de moléculas representantes de todo o genoma, ou de coleções de clones de cDNAs derivados de toda a população de mensageiros da célula ou tecido de interesse. Essas coleções de clones de DNA recombinante são chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genômica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genômico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construídos a partir de DNA complementar. O DNA de organismos superiores é bastante complexo: por exemplo, o genoma haplóide de mamífero é composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreenderá somente 1 parte em 106 de uma preparação do DNA total. De modo similar, uma espécie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da fração de RNA mensageiros de uma célula. Deste modo, para que seja garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as seqüências da população alvo, um dos pontos principais na construção de bibliotecas úteis é a obtenção de grandes quantidades de clones. Embora a solução deste problema envolva estratégias específicas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs segue um procedimento básico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genômico ou os cDNAs são preparados para a inserção no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo são ligados e introduzidos em E. coli através de infecção ou em alguns casos, por transformação direta (Figura 20). 1. Biblioteca de CDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vírus de RNA de tumor, tornou possível a síntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reação é o DNA complementar ou cópia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A síntese e possível clonagem de cDNAs contribuíram para grandes avanços na análise da estrutura e expressão de genes de eucariotos e propiciaram uma revolução tecnológica nas indústrias farmacêutica e de alimentos. Esses clones são comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construídas a partir da população de RNAm isolada da célula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparação com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas são enriquecidas com seqüências gênicas. Uma vez que o cDNA é cópia da mensagem, ele não contém introns e apresenta significativamente poucas seqüências que não codificam para proteínas (Figura 21). A ausência de introns permite que cDNAs relativos a células de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactérias e em outros microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios importantes tanto na área de pesquisa como na área aplicada. A ausência de introns também facilita a determinação direta da seqüência da mensagem e subseqüente dedução da seqüência de aminoácidos da proteína por ela codificada. Isso tem resultado na identificação da seqüência de uma enorme quantidade de proteínas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas genética ou bioquimicamente. Figura 20. Passos envolvidos na construção de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genômicas. 18 Escolha do Vetor mRNA Tecido DNA cDNA Digerir o DNA, Fracionar por tamanho DNA clonável Titulação e caracterização da Biblioteca Ligar DNA a um vetor Introduzir o produto da ligação em E.coli Parcial ou completamente Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenças entre um fragmento de DNA genômico e do cDNA relativo a ele. De modo resumido, o procedimento para a síntese, clonagem e isolamento de cDNAs específicos envolve 4 etapas: 1) Síntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor escolhido. 3) Introdução dos cDNA recombinantes nas células hospedeiras, onde serão replicados. Isto resultará na amplificação dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expressão das proteínas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes. 1.1. Síntese de cDNAs de fita dupla A construção de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total do tecido e subseqüente seleção da fração de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na célula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade é essencial, uma vez que qualquer degradação do RNAm afetará a representatividade das seqüências na biblioteca. Uma vez obtida a fração de RNA poli(A)+, procede-se à síntese dos cDNAs através de uma série de reações enzimáticas (Figura 22). Nos últimos dez anos foram descritos vários métodos para síntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado para esse fim: a) Síntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) através da enzima transcriptase reversa. Essa enzima é capaz de catalisar in vitro a polimerização de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a síntese. Na maioria das vezes, a molécula utilizada como "primer" é um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA. b) Após a síntese dessa fita de cDNA, o RNAm é parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaços do RNA da molécula híbrida RNA-DNA. c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA não digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma molécula de cDNA de fita dupla. d) O cDNA fita dupla é tratado com T4 polimerase. Através da atividade 3'-5' exonucleásica dessa enzima remove-se possíveis nucleotídeos extras nas extremidades 3'. e) O produto final desse conjunto de reações é uma molécula de DNA de fita dupla, cópia exata da mensagem. 1.2. Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor Uma vez obtido o cDNA, o próximo passo é prepará-lo para a inserção em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso também existem vários métodos disponíveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmídio ou fago. O fago λ tem sido o vetor de escolha para a construção de bibliotecas de cDNA. A razão básica desta preferência é a eficiência. Em comparação com plasmídios, o fago λ requer cerca de 16 vezes menos cDNA por µg do vetor para produzir número equivalente de clones recombinantes. Além disso, bibliotecas em fago λ são mais fáceis de serem manipuladas do que bibliotecas em plasmídios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores λ é que não são favoráveis para procedimentos de seqüenciamento do DNA e de mutagênese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficiências. Essa classe de vetores compreende os fagemídios que, como o próprio nome sugere, são plasmídios contendo porções do genoma de fago e que reúnem vantagens desses dois vetores. 19 Figura 22. Síntese de cDNA fita dupla. Para dar uma noção dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago λ. metilação dos sítios de EcoRI através do tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. Esse passo é essencial para proteger os sítios EcoRI que possam existir no cDNA contra a ação da EcoRI em digestão a ser realizada subseqüentemente no processo de clonagem. adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reação resulta em moléculas de cDNA com adaptadores múltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23). um único sítio de EcoRI é produzido em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na molécula. A metilação prévia do cDNA garante que não haja digestão interna do cDNA. antes de ser inserido no vetor, o cDNA é separado do excesso de moléculas de adaptadores. Isso é feito através de filtração em colunas de Sephadex. as moléculas de cDNA são ligadas ao vetor, através de reação com T4 ligase. o produto da ligação é empacotado com as proteínas formadora do capsídeo do fago. os fagos obtidos são utilizados para infectar bactéria de linhagem que favorece o crescimento dos recombinantes. após a infecção da bactéria com os cDNA recombinantes temos como produto uma biblioteca de cDNA, que deve conter cópias de toda as seqüências de RNAm da população original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca do clone de interesse. 2. Biblioteca genômica Para se obter informações sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos é necessário o isolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de transcrição, mais as regiões flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa porção do DNA é através do uso de uma biblioteca genômica, que deve conter clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questão. Deste modo, o aspecto principal considerado na construção de uma biblioteca genômica está na obtenção de um número grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratégia básica na construção de bibliotecas genômicas busca minimizar o número de clones necessários através da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possível, e maximizar a eficiência da clonagem, através da utilização de vetores baseados no fago λ. Basicamente, a construção da biblioteca genômica envolve os seguintes passos: isolamento de DNA de alto peso molecular, que é posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho 20 B=BamHI; E=EcoRI. Conforme indicado no diagrama este vetor apresenta um fragmento central flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e esquerdo). O fragmento à esquerda, chamado de braço esquerdo, codifica para as proteínas do capsídeo e o fragmento à direita, chamado de braço direito, contém a origem de replicação do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços encontram-se os sítios de restrição utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientação inversa. Como todo fago λ, a extremidade de cada braço apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos são complementares entre si e permitem a recircularização da molécula, e a conseqüente replicação do DNA do fago dentro da célula hospedeira. Esse tipo de vetor é chamado de vetor de substituição por que no processo de clonagem a parte central do DNA do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando a molécula recombinante. Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes insertos foram desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) são moléculas lineares de DNA cuja arquitetura mimetiza a estrutura de um cromossomo autêntico (Figura 26). Os YACs recombinantes são criados pela ligação de fragmentos grandes de DNA genômico exógeno (até 2000 kb) com os dois "braços" do vetor YAC e o produto da ligação é introduzido na levedura por transformação. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA genômico exógeno é flanqueado de um lado por um centrômero, uma origem de replicação e uma marca de seleção e pelo outro lado, por uma segunda marca de seleção. As leveduras transformantes com cromossomo artificial são selecionadas como colônias em meio com as drogas de seleção. Os cromossomos artificiais de bactérias (BAC) são moléculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleção a antibiótico. Os segmentos de DNA genômico exógeno são clonados no vetor BAC in vitro e o produto da reação de ligação é introduzido por eletroporação em cepas de E. coli, onde é mantido como um plasmídio de cópia única. Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminação dos clones vazios e cheios. A média de tamanho dos clones de BACs é 120 kb, mas alguns clones podem chegar 300kb. Os vetores de bacteriófago P1 acomodam fragmentos genômicos de 70 a 100Kb. Neste sistema, as moléculas lineares recombinantes geradas a partir de seqüências do vetor e do genoma são empacotadas in vitro em bacteriófago P1. Após a injeção em E. coli, as moléculas se tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a recombinação de seqüências específicas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca de seleção para antibiótico, marca de seleção positiva para seleção dos clones com inserto de DNA genômico exógeno e uma origem de replicação plasmídial P1, que mantém uma ou duas cópias dos plasmídios recombinantes na célula. Uma segunda origem de replicação pode ser ativada para amplificação dos plasmídios antes do isolamento do DNA. 23 Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor YAC carrega uma origem de replicação (ORI), um centrômero (CEN), dois telômeros e marcas de seleção (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139. Os cromossomos artificiais P1 combinam as características dos bacteriófagos P1 e dos BACs, incluindo a marca de seleção positiva e as origens de replicação do bacteriófago P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reação de ligação in vitro são introduzidos em E.coli por eletroporação e mantidos como um plasmídio de cópia única na célula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de 60kb a 150kb. IV. Detecção e ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante é encontrar o clone correto na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confecção da biblioteca genômica ou de cDNA. Embora seja relativamente fácil selecionar as colônias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistência a antibióticos que estão presentes nos vetores (Figura 27A), é muito mais difícil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmídio deverão ser examinadas milhares de colônias de bactérias crescidas em placas de petri contendo agar, para a detecção daquela(s) colônia(s) que produza(m) pequenas quantidades da proteína expressa pelo gene de interesse ou então que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expressão protéica que o caracterize (Figura 27B). Será discutida inicialmente a situação na qual a proteína é expressa no hospedeiro. Em seguida será discutida a situação mais comum onde a proteína não é expressa e a análise será feita através da própria presença do DNA de interesse no fago ou na bactéria. 1. Quando o gene de interesse é expresso no hospedeiro Se o gene de interesse é capaz de se expressar na célula hospedeira pode-se identificar o clone que carrega este gene pela presença desta proteína entre as colônias recombinantes. Para isto, o hospedeiro não deve produzir esta proteína, a menos que ele carregue o clone que a produza. Se esta proteína for produzida normalmente pela célula hospedeira, será então necessário o uso de uma célula hospedeira defectiva ou mutante para o gene de interesse. Quando este gene for incorporado ele pode ser detectado por complementação daquela função. Se a proteína a ser detectada for específica de mamífero, por exemplo, a célula hospedeira já será naturalmente defectiva. Se a proteína for uma enzima que catalisa uma reação mensurável pode ser possível triar as colônias por sua atividade enzimática. Se a proteína de interesse não for uma enzima com função detectável, uma outra estratégia será necessária para a 24 identificação do clone correto, como por exemplo, o uso de um anticorpo específico para a proteína de interesse. Anticorpo é uma proteína do soro produzida pelos mamíferos que se combina com alta especificidade com outra proteína, o antígeno. Neste caso, a proteína de interesse é o antígeno. Como o anticorpo se combina especificamente com o antígeno, se o antígeno estiver presente em uma ou mais colônias de uma placa de petri, a identificação destas colônias poderá ser feita observando-se a reação antígeno-anticorpo. Figura 27. Em A, estrutura do plasmídio pBR322, um típico vetor de clonagem. Em B, método da inativação insercional para isolar plasmídios contendo DNA exógeno. A inserção do DNA exógeno no plasmídio pBR322 causa inativação da resistência à tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126. Para que o antígeno seja produzido na célula hospedeira a biblioteca de cDNA terá de ser construída num vetor de expressão. Neste caso os cDNAs são inseridos nestes vetores em regiões que promovam sua expressão em E.coli, normalmente em promotores que possam ser regulados. Esta proteína antigênica será expressa como uma proteína de fusão, ou seja, será sintetizada subseqüente a alguns aminoácidos pertencentes à proteína do vetor bacteriano. Estas proteínas de fusão são geralmente mais estáveis que a correspondente proteína de eucarioto produzida em bactéria e, portanto podem ser obtidas em grande quantidade. Para visualizar a produção destas proteínas, uma parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactérias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri são transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas proteínas e então submetidos a uma solução contendo um anticorpo específico para a proteína desejada. Depois que os anticorpos livres são removidos, um segundo anticorpo é adicionado para localizar a posição do primeiro. O segundo anticorpo é normalmente radioativo e pode ser identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colônia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X será observada depois que o filme for revelado (Figura 28). A localização desta mancha no filme corresponde à localização da colônia que produziu aquela proteína, na placa de petri original. Esta colônia será então recuperada da placa original e cultivada. Uma limitação deste procedimento é que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser específico para a proteína de 25 Figura 29. Triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA, construídas no fago λ, com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem é feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactérias, em várias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visíveis, são feitas as réplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA é exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posição do clone recombinante de interesse é identificada através de autoradiografia. O DNA é isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetida a análises posteriores. Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulação podem ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridação diferencial. Isto é, genes expressos em tecidos específicos, em estágios específicos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados por fatores de crescimento são adequados para serem analisados por este tipo de abordagem. Para esta identificação é necessário produzir duas populações celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes 28 Membrana de nitrocelulose Placas de lise Fagos absorvem a nitrocelulose Placa mestra Membrana réplica Sonda de ácido nucleico marcada com 32p Sonda Hibridiza DNA ligado ao filtro Lavagem das sondas não incorporadas Sonda hibridiza ao DNA do fago que contem a sequência complementar Filme de raio-X Placa mestra DNA lambda isolado da placa de lise DNA clonado Clone lambda purificado tecidos) uma na qual eles não se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de células tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca é plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto é ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrição reversa do RNA das células tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros é hibridado com cDNA preparado de células não tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzíveis pelos fatores de crescimento (Figura 30). Quando o DNA a ser clonado expressa uma proteína cuja seqüência é conhecida pode-se inferir a seqüência de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar oligonucleotídeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotídeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotídeos de comprimento para ser específico para a seqüência procurada. Um problema enfrentado para sintetizar estes oligonucleotídeos é a degenerecência do código genético. Alguns aminoácidos são codificados por quatro ou mesmo seis diferentes códons e, portanto mesmo um pequeno polipeptídio pode ter sido codificado por várias seqüências de DNA. Para contornar este problema as sondas oligonucleotídicas são algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todas as possíveis combinações dos códons que são traduzidas naquela seqüência protéica (Figura 31). Uma destas seqüências é correta e irá hibridar com o clone de interesse, mas a possível hibridação dos outros oligonucleotídeos com seqüências sem interesse pode levar a obtenção de clones falsos positivos. Uma variação deste método é utilizar o menor número possível de oligonucleotídeos como sonda, escolhendo a região da proteína que contém o menor número possível de códons degenerados (por exemplo, metionina é somente codificada pelo códon AUG). Deve-se levar em conta também qual é o códon de uso mais freqüente para cada aminoácido, na espécie que está sendo analisada. 29 AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA Células com fatores de crescimento Células Quiescentes Cresce em 3 hs Isola o mRNA poli(A) Isola o mRNA poli(A) mRNA induzido pelos fatores de crescimento Oligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridação Oligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridação Prepara bibliotéca de cDNA com fago lambda e infecta Ecoli Placa mestra Réplica em membrana de nitrocelulose Autoradiográfia Autoradiográfia Filme de raio-X Filme de raio-X cDNA comum Clone de cDNAindusível por fatores de crescimento Isola o clone do fago Placa mestra Hibridação negligenciavel Figura 30. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento através de hibridação diferencial. Esta estratégia é utilizada para clonar uma família de genes que são induzidas quando células quiescentes são estimuladas a crescer pela adição dos fatores de crescimento. Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotídicas baseadas na seqüência protéica. Como a maioria dos aminoácidos é especificada por dois ou mais códons estes oligonucleotídeos são sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotídeos das posições ambíguas. A seqüência correta estará representada entre os oligos. Uma outra possibilidade é usar uma sonda tentativa cuja escolha é baseada na freqüência de uso do códon na espécie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer. 3 Análise do DNA e RNA por eletroforese em gel e “blotting” Várias técnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridação dos ácidos nucléicos visando a triagem e isolamento de seqüências específicas destas moléculas. A maioria destas técnicas, conforme já mencionado, trabalha 30 TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATTTC C T A G A G A G C T A C CG A C G T TGTATGGATGAAATGAA TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGCATGGATGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC TGCATGGACGAAATGAA TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC ---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG--- ---ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG--- 5' 5' 5' 3' 3' 3'G C T A Cys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-Ile Sequência Parcial de Aminoácidos Sequências Possíveis do DNA Parte da sequência com pouca ambigüidade Sondas contendo todas as possíveis combinações de condons de parte da sequência Sonda tentativa Hibridação com cDna sendo que as fitas de DNA recém sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo é sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 35). Usualmente, são realizados de 20 a 30 ciclos para amplificação de um segmento de DNA específico dentro de um genoma. Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichi coli, que possui atividade máxima a 37°C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo pois o passo de desnaturação inativa a enzima. Um importante avanço ocorreu com a descoberta da enzima Taq DNA polimerase (Saiki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade ótima a 72°C e permanece razoavelmente estável mesmo a 95°C e com isto, a enzima é adicionada somente no inicio do processo . Figura 35. Os primeiros 4 ciclos de um PCR em detalhes.No terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto são copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o tamanho são copiadas (http:// allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html). Além de ser utilizada para a amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode ser utilizada para amplificar um segmento ou toda a seqüência de um produto gênico. Isso pode ser feito a partir da população de RNA de uma determinada célula ou tecido. Entretanto, como a Polimerase utilizada na metodologia de PCR é uma DNA Polimerase depedente de DNA, ela não pode usar RNA diretamente como molde para a amplificação. Assim, inicialmente é realizada uma reação de transcrição reversa, onde pela ação da transcriptase reversa o RNA é utilizado como molde para geração de cDNA, que é então utilizado como molde em uma PCR subsequente. Essa abordagem denominada de RT-PCR (Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction) é muito útil para se analisar de maneira rápida a expressão de genes de interesse, pois uma vez que a PCR é realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse só será amplificado naquelas células ou tecidos onde o gene é expresso. Esta técnica pode ser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse, desde que já se tenha alguma informação de sua seqüência, sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isolá-lo. VI. SEQÜENCIAMENTO DE DNA A partir do final da década de 70 tornou-se possível a determinar a seqüência nucleotídica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger e cols associado a avanços tecnológicos, permite que hoje genomas inteiros sejam seqüenciados. O princípio do método de terminação da cadeia para seqüenciamento de DNA baseia-se na síntese de DNA in vitro realizada na presença didesoxirribonucleotídeos. Um DNA purificado pode ser sintetizado in vitro em uma mistura que contém moléculas de fita única de DNA, enzima DNA polimerase, um DNA iniciador que possibilita a polimerase iniciar a síntese de DNA utilizando os desoxirribonucleotídios. Alternativamente, na presença de didesoxirribonucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) na reação, o elongamento da cadeia de DNA é bloqueado pela incorporação do nucleotídeo sem um grupo OH na posição 3'. 33 No método originalmente desenvolvido por Sanger para seqüenciamento de DNA, uma fita complementar é sintetizada utilizando um mistura de desoxirribonucleotídeos, um deles marcado com P32 ou S35. São realizadas 4 reações independentes, contendo uma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotídio em cada uma das reações. Cada reação produz um conjunto de cópias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqüência. Os produtos destas quatro reações são separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos são detectados através da marcação radioativa. Em cada um das raias, as bandas representam fragmentos que foram terminados em dado nucleotídeo em diferentes posições do fragmento inicial de DNA. Pela análise da ordem das bandas, começando pelo final do gel através das quatro raias, pode-se determinar a seqüência do DNA recém sintetizado (Figura 36). Este método ainda é amplamente utilizado, sendo que vários avanços tornaram o seqüenciamento de DNA uma técnica simples e rápida. Os principais avanços foram a adaptação da PCR ao método de terminação da cadeia e a utilização de didesoxirribonucleotídeos marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos). A utilização de fluorocromos permite que todas as quatro reações sejam realizadas em um único tubo e o produto da reação de seqüenciamento seja separado em uma única raia do gel. Figura 36. Seqüenciamento de nucleotídeos pelo método do término do crescimento da cadeia. Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352. Atualmente, todo o processo de seqüenciamento de DNA pode ser realizado em seqüenciadores automáticos. Nestes equipamentos o produto da reação de seqüenciamento é separado por eletroforese em gel ou em capilar, os fluorocromos são excitados por um feixe laser, os sinais fluorescentes são amplificadas e detectados por tubos fotomultiplicadores ou nos modelos mais modernos por câmaras CCD. Análises computacionais identificam cada nucleotídeo pelo comprimento de onda de emissão específico de cada fluorocromo. As bases são identificadas de acordo com a forma do pico fluorescente e a distância entre picos sucessivos (Figura 37). Figura 37. O produto da reação de seqüenciamento é submetido à eletroforese em uma raia de gel. À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de seqüência através de um computador. 34 VII. Expressão de proteínas heterólogas 1. Introdução A descoberta de promotores e repressores específicos do genoma de E. coli, de uma variedade de vírus de E. coli e de células eucarióticas permitiu a manipulação da expressão de proteínas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expressão pode ser indutível ou contínua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. coli é baseado no operon lac (Figura 38). Neste sistema, o DNA de interesse é clonado em fago (no caso de biblioteca de cDNA de expressão) ou plasmídeo contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da β-galactosidase). A indução da transcrição é obtida pela adição de um análogo de lactose sintético e não degradável (isopropiltio-β-D-galactosídeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o promotor livre para a interação com a RNA polimerase e consequente transcrição do gene. Figura 38. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac. (a) Na ausência de indutor. (b) Na presença de indutor. O sistema mais comumente utilizado para expressão de proteínas heterólogas é o que utiliza E. coli como célula hospedeira. Este sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli, e pela reprodutibilidade e abundância de proteína que produz. Além disso, modificações nos vetores e linhagens de E. coli são frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficiência e versatilidade do sistema original. Com isto, e com o advento de novos sistemas de expressão em células de eucariotos (levedura, insetos, mamífero), a expressão de proteínas clonadas tornou-se uma abordagem poderosíssima que vem revolucionando os estudos de estrutura, função, purificação e identificação de novas proteínas. Nestes outros sistemas, o recombinante a ser introduzido no hospedeiro alvo pode ser facilmente construído e amplificado em E. coli. Por isso os plasmídeos de levedura, mamífero, etc. são construídos por fusão de uma porção de um plasmídeo de E. coli (origem de replicação e resistência a um antibiótico) com seqüências específicas para se obter expressão em célula eucariótica, conforme veremos adiante. 2. Expressão de proteínas heterólogas em E.coli O uso de E. coli para a obtenção de proteína em quantidade suficiente para o estudo da estrutura e função da mesma ou para aplicações clínicas ou industriais é hoje disseminado e constitui-se em um marco na história do nosso conhecimento de estrutura de proteínas. Este tópico pretende sobretudo descrever os passos básicos envolvidos na construção de recombinantes e expressão, em bactéria, de uma proteína clonada. 2.1 Subclonagem em plasmídeos de expressão O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expressão é exatamente igual a qualquer clonagem, no 35 Gene estrutural Gene estrutural transcrição Eliminada Retida Separação CLIVAGEM (proteólise) Lavagem Eluíção EXPRESSÃO (INDUÇÃO) PLM CLONAGEM (a) pMALc Proteina de interesse PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE Fator Xa Figura 40. Subclonagem de um fragmento de DNA em plasmídeo de expressão e análise de restrição de dois recombinantes obtidos. Nota : Os clones 1 e 2 foram digeridos com BamHI e Hind III, separadamente. Responda: Qual dos dois clones tem o inserto na orientação correta (senso) para a expressão da proteína? Em geral projeta-se ainda um sítio sensível a uma determinada protease (ex: fator Xa, trombina), inserido imediatamente acima do sítio de clonagem, de maneira que a proteína híbrida possa ser clivada liberando a proteína clonada que pode então ser facilmente purificada utilizando-se a mesma coluna de afinidade. A coluna reterá a proteína de fusão e eliminará no "void" a proteína de interesse. Um exemplo de proteína híbrida obtida por clonagem no vetor pMAL é dado na Figura 41. O procedimento de proteólise é relativamente trabalhoso e nem sempre eficiente, por isso quando a proteína de fusão não interfere se utiliza a própria proteína híbrida, por exemplo, para experimentos funcionais, produção de anticorpos, etc. Note que neste caso pode ser estratégico ter o mesmo DNA clonado em dois sistemas de fusão diferentes. Isto permitirá que anticorpos produzidos contra uma proteína híbrida sejam purificados por afinidade contra a outra, purificando-se assim apenas anticorpos cujos epitopos localizam-se na proteína clonada. Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produção de proteínas híbridas podemos citar: pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como proteína de fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna de agarose-glutationa pMAL: apresenta a proteína ligante de maltose (PLM) de bactéria (42 kDa) como fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna com amilose acoplada pQE: apresenta um “tag” de 6 resíduos de histidina como fusão e permite a purificação das proteínas de fusão em colunas quelantes de Ni2+ pUR: cuja fusão é um fragmento da β-galactosidase A produção de proteínas híbridas é geralmente muito simples, eficiente e de baixo custo financeiro, podendo suprir de imediato necessidades da pesquisa básica, tais como, produção de anticorpos e purificação destes por afinidade, sondas em experimentos variados e para estudos funcionais/estruturais da proteína expressa. Permite, também, a expressão em grande escala, para fins industriais ou clínicos de enzimas, hormônios, anticorpos, etc., quando a atividade da proteína é preservada. Além disto, é possível se obter, por mutagênese, proteína com a atividade de interesse potenciada e livre de efeitos adversos ou atividades indesejadas. (b) Figura 41. a) Esquema ilustrando os passos para a expressão, purificação e clivagem de uma proteína de fusão. b) Gel de poliacrilamida-SDS de frações da purificação da proteína de fusão PLM-paramiosina. Em A são mostrados os extratos de células não induzidas (1) e de células induzidas (2). Em B, proteína de fusão PLM- paramiosina após eluição da coluna de amilose por adição de maltose (1), após clivagem por fator Xa (2) e fração coletada no "void"após passagem na coluna para a retenção da PLM (3). 38 É importante estar alerta de que a situação ideal exposta acima nem sempre é atingida. Na realidade, na grande maioria das vezes, proteínas de eucarioto produzidas em bactéria não são solúveis; às vezes podem ser tóxicas para a célula; algumas são expressas em baixos níveis; algumas interferem com a sua fusão inibindo-a de se ligar à resina de afinidade e tornando a purificação menos eficiente; outras formam agregados extremamente insolúveis mesmo na presença de SDS/β-mercaptoetanol; algumas têm a sua atividade biológica plenamente recuperada, porém outras são inativas. Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produção de proteínas heterólogas em E. coli, podemos citar: Proteínas tóxicas: algumas proteínas são tóxicas para a célula hospedeira. Neste caso, pode-se proceder a secreção. Uma alternativa à produção de proteína citoplasmática, é a produção de proteínas que são secretadas. Para tanto basta clonar o DNA codificante em fusão com uma seqüência codificante para um peptídeo sinal de procarioto. Este peptídeo é clivado pela peptidase sinal quando a proteína é secretada para o periplasma. Embora este método freqüentemente traga problemas com o rendimento ou a clivagem do peptídeo sinal, há vantagens em alguns casos: no caso de proteínas tóxicas para a bactéria; algumas proteínas degradadas por protease no citoplasma são estáveis no periplasma; algumas que são inativas quando produzidas intracelularmente são ativas quando secretadas; a proteína produzida já tem a sua metionina N-terminal processada. Um exemplo de sucesso é a expressão do hormônio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqüência sinal desta. A indução é obtida sob privação de fosfato do meio. Proteínas instáveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactéria deficiente em uma ou mais proteases. Mesmo assim é comum se obter algum nível de fragmentação da proteína expressa (ver Fig. 39 b, raia 1). Baixos níveis de expressão: pode ocorrer pelas razões acima dentre outras, como, por exemplo, instabilidade do mRNA, término prematuro da mensagem, tradução ineficiente. Proteínas insolúveis: proteínas de eucariotos produzidas em bactéria são geralmente precipitadas na forma de corpos de inclusão e requerem procedimentos adicionais de desnaturação para solubilizá-las e de renaturação para mantê-las solúveis e funcionais. Isto nem sempre é um problema, pois a formação de corpos de inclusão pode proteger a proteína contra a degradação por proteases bacterianas e também facilitar a purificação, uma vez que são corpos densos, precipitados à baixa velocidade de centrifugação, enquanto a maior parte das proteínas bacterianas permanecem no sobrenadante. Mas algumas vezes não se consegue renaturação adequada da proteína purificada. Neste caso deve-se tentar atenuar a formação de corpos de inclusão alterando as condições de expressão, por exemplo, crescendo-se a cultura a temperatura mais baixa após a indução ou utilizando um promotor mais fraco. 3.2. Produção de proteínas intactas A vantagem de se produzir proteína intacta sem fusão é que ela poderá ser utilizada sem a preocupação de que o segmento de fusão esteja interferindo em sua estrutura e atividade. A principal desvantagem é que nem sempre se encontra um método eficaz para a purificação da mesma. Contudo há exemplos demonstrando que para estudos funcionais e de estrutura é preferível investir na produção de proteína intacta. Vários vetores encontram-se disponíveis no mercado para a expressão de proteínas sem fusão em E.coli. Os mais referidos são da série pET (plasmid for expression by T7 RNA polimerase), cuja expressão está sob o controle do promotor de transcrição φ10 e dos sinais de iniciação de tradução s10 da proteína do gene 10 (a principal proteína do capsídeo) do bacteriófago T7. A grande vantagem deste vetor é que ele é transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual é muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rápido que a RNA polimerase de E. coli. Alguns vetores da série pET apresentam o promotor T7-lac, colocando a expressão da proteína sob o controle lac e reduzindo portanto o background de expressão da proteína alvo na ausência de IPTG. 4. Expressão de proteínas heterólogas em organismos eucariotos Ao se escolher um sistema de expressão, deve-se sempre considerar a aplicação final da proteína a ser expressa. Embora o sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. coli seja bastante difundido, no caso de proteínas eucarióticas complexas torna-se, as vezes, necessário lançar-se mão de sistemas de expressão em células eucarióticas para se produzir proteínas na sua forma nativa, pois estes sistemas permitem modificações pós-traducionais essenciais para a função de determinadas proteínas, como, por exemplo, glicosilação. Consideraremos alguns destes sistemas a seguir. 4.1. Expressão em células de mamíferos Os vetores para expressão em mamíferos contém sequências para facilitar a propagação em bactéria (origem de replicação e um marcador para seleção), bem como seqüências específicas para se obter expressão em células eucarióticas. Assim, um vetor para expressão em células de mamíferos deve apresentar as seguintes características: origem de replicação para células eucarióticas: por exemplo a do vírus SV40 promotor: como, por exemplo, do SV40 ou do citomegalovírus (CMV). Existem também vetores com promotores induzíveis como, por exemplo, o da tetraciclina e o responsivo à ecdisona. sinais para o término da transcrição e para a poliadenilação do transcrito marcador para seleção: como por exemplo o gene que codifica a aminoglicosídeo fosfotransferase, conferindo 39 resistência à geneticina (um análogo de neomicina). sequência para ligação ao ribossomo (sequência de Kozak) Os sistemas de expressão em células de mamíferos podem ser divididos em dois tipos: a) aqueles envolvendo expressão transitória da proteína em questão (1-4 dias após a introdução do DNA); b) aqueles envolvendo a expressão estável e que requerem, portanto, a integração do gene no DNA cromossômico. 4.2 Expressão em fungos Fungos são eucariotos unicelulares potencialmente capazes de realizar todas as modificações pós-traducionais observadas em células de mamíferos. A facilidade de cultivo em larga escala e o fato de S. cerevisiae ser um microrganismo seguro, legalmente usado na indústria de alimentos e farmacêutica, são características adicionais que tornam a expressão heteróloga de proteínas neste sistema particularmente atrativa e com perpectivas para uso, por exemplo, no desenvolvimento de vacinas orais através da imobilização de antígenos na superfície deste microrganismo. Exemplos da expressão de proteínas heterólogas em fungos encontram-se descritos nos ítens 7.1.2 e 7.2. 5. Sistema de expressão em células de inseto utilizando Baculovírus como vetor É um dos sistemas de expressão em células eucarióticas mais poderosos e versáteis. O genoma do Baculovírus é muito grande para permitir a inserção direta de genes heterólogos; por isso, estes são clonados em vetores de transferência, os quais contém sequências flanqueadoras que são homólogas (5’ e 3’ ao inserto desejado) ao genoma do Baculovírus. Procede-se, então, à co-transfecção do vetor de transferência contendo o gene de interesse clonado e do DNA linearizado do vírus Autographa californica (AcNPV) em células do inseto Spodoptera frugiperda (Sf). Nestas células ocorre recombinação homóloga, com transferência do gene heterólogo do vetor para o DNA do AcNPV. A infecção das células Sf com o DNA do vírus resulta na parada total da expressão das proteínas do hospedeiro, permitindo alta produção do mRNA e da proteína recombinantes. Uma variedade de vetores de transferência foram construídos para utilização neste sistema. Cada vetor contem : uma origem de replicação de E.coli um marcador de resistência à ampicilina o promotor da polihedrina ou da p10 (proteínas do baculovírus): promotores fortes. um MSC para permitir inserção do gene de interesse sequências flanqueadoras pertencentes ao genoma do vírus para facilitar a recombinação homóloga Vantagens deste sistema de expressão: Modificações pós-traducionais Obtenção de proteínas solúveis e funcionalmente ativas Altíssimos níveis de expressão Capacidade para grandes insertos Expressão simultânea de vários genes: vários plasmídeos com promotores múltiplos encontram-se disponíveis comercialmente, permitindo a expressão de duas ou mais proteínas numa única célula infectada. Facilidade de purificação: vetores apresentando “tags” de 6xHis e GST permitem a purificação por afinidade das proteínas recombinantes. Facilidade de monitoramento da expressão: vetores Biocolors permitem a obtenção da proteína de interesse em fusão com GFP (green), BFP (blue) ou YFP (yellow), permitindo o monitoramento da expressão sem a necessidade da utilização de anticorpos. 6. Expressão em células de DROSOPHILA Combina algumas das melhores características dos sistemas de expressão em células de mamífero com aqueles em células de insetos utilizando baculovírus. É um sistema mais barato e eficiente que expressão em células de mamíferos e mais rápido que expressão utilizando baculovírus. Este sistema utiliza vetores plasmidiais para expressão transitória ou estável da proteína de interesse. Encontram-se disponíveis comercialmente vetores para expressão: a) constitutiva (promotor da actina), b)induzível (promotor da metalotioneína, expressão induzida pela adição de cobre ou cádmio) e c) indúzivel e com secreção da proteína para o meio. Todos os vetores apresentam “tags” de 6xHis no C-terminal, facilitando a purificação por afinidade da proteína de interesse. 7. EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS: APLICAÇÕES E PERSPECTIVAS 7.1- Bibliotecas de expressão e identificação de novas proteínas através de anticorpos ou outros ligantes específicos 7.1.1- Sistema convencional - expressão de biblioteca de cDNA em E. coli Vocês já viram em capítulos anteriores que uma biblioteca de cDNA pode ser construída em vetor de expressão (fago ou plasmídeo). Para essa finalidade, um dos vetores mais utilizados atualmente, pela sua versatilidade, é o λZAP e o hospedeiro mais usado é E. coli. Quando se clona um dado fragmento de DNA pode-se planejar previamente se deseja- se uma clonagem uni ou bidirecional. Quando se sintetiza uma biblioteca de expressão é usual que se opte pela clonagem unidirecional. Para isso basta digerir o vetor com duas enzimas que geram pontas incompatíveis e preparar o inserto com adaptadores que geram pontas compatíveis com as do vetor, de tal maneira que a orientação seja a correta (fita sense, sentido 5'→3', a partir do promotor) para a expressão de proteína. A biblioteca é amplificada como qualquer outra e a expressão de proteína é induzida pela adição de IPTG; uma réplica da placa de ágar contendo as placas de lise 40 Figura 44. Estratégia para detectar proteínas ligantes utilizando o sistema de dois híbridos. 7.2. A utilização da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento de receptores de membrana Para informações específicas em clonagem de receptores de superfície celular, incluindo abordagens que visam descobrir ou projetar novas drogas efetivas direcionadas a esses receptores, consulte a revisão de Luyten & Leysen (1993). Estes autores enfatizam que a expressão heteróloga de receptores clonados proporciona uma fonte rica, reprodutível, inexaurível e barata de subtipos de receptores humanos. Esses receptores expressos podem ser utilizados no “screening” de drogas e também para o “design” de novas drogas através de um melhor entendimento da relação estrutura-função, visto que a clonagem molecular desses receptores revelou uma abundância de subtipos, bem como modelos estruturais dos mesmos (Figura 45). Agora, uma nova era pode ter lugar, em que as drogas começam a ser projetadas e construídas com base na estrutura de seu alvo no organismo (Bugg et al., 1994). Exemplos da utilização da tecnologia do DNA recombinante neste caso incluem a expressão heteróloga de receptores acoplados a proteína G nos fungos Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris, visando estudos estruturais e funcionais. Células de S. cerevisiae expressando o receptor de somatostatina de rato foram usadas com sucesso no “screening” de análogos de somatostatina e bibliotecas combinatoriais para identificar agonistas e antagonistas seletivos para subtipos com potentes efeitos in vivo (M. H. Pausch, 1997). 43 X X Y Y (a) GAL4 nativa (b) Híbrido com domínio ligante de DNA da GAL4 (c) Híbrido com domínio da GAL4 ativador da transcrição (d) Interação entre híbridos reconstituindo a atividade da GAL4 Gene HIS3 Gene HIS3 Gene HIS3 Gene HIS3 transcrição Transcrição Figura 45. Modelos estruturais de famílias de receptores de superfície celular. Os domínios trans-membrana e alguns domínios funcionais são representados. O enrolamento da cadeia proteica é hipotético, pois o único que teve sua estrutura determinada por cristalografia até o momento foi o domínio extracelular do receptor de hormônio de crescimento. 7.3. Expressão de proteínas para intervenção terapêutica Podemos dizer que há duas maneiras gerais de se fazer terapêutica por expressão de proteínas: a) a expressão heteróloga de uma proteína humana em bactéria ou célula eucariótica para a produção em grande escala, purificação e utilização desta para injeção em pacientes: o exemplo mais conhecido é provavelmente o da insulina (Bristow, 1993), a qual foi o primeiro produto comercial obtido pela tecnologia do DNA recombinante e aprovado para uso em humanos em 1982 pela U.S.FDA (Food and Drug Administration). A Figura 46 mostra as estratégias empregadas para a produção de insulina para fins terapêuticos; a bovina e a suína sem modificações químicas são menos eficientes. A insulina produzida pela tecnologia do DNA recombinante apresenta a vantagem de eliminar a possibilidade de contaminantes ou agentes infecciosos que podem estar presentes nas proteínas purificadas de animais. Uma das maiores expectativas neste campo é a possibilidade de se obter mutantes com atividade muito superior ao da proteína nativa e sem certos efeitos adversos. Outros exemplos de produtos obtidos pela tecnologia do DNA recombinante e utilizados com finalidade terapêutica são o anticoagulante TPA (ativador de plasminogênio tipo tecidual), o fator VIII de coagulação e a eritropoietina (hormônio que estimula a produção de eritrócitos). A determinação e caracterização refinada da estrutura de proteínas começa a ganhar maior impacto pela possibilidade de expressão/purificação de proteína em larga escala e mutagenisadas. Além de nos proporcionar a satisfação de se conhecer uma nova estrutura, esse conhecimento nos permite projetar drogas e pensar em outras estratégias terapêuticas, 44 tais como, expressar apenas um domínio ativo da proteína. Por exemplo, os domínios variáveis de anticorpos podem ser expressos como uma única cadeia polipeptídica ativa. Pode-se pensar também na expressão de receptores solúveis (ou domínios ativos destes) para um dado vírus, no sentido de inibir a sua interação com o receptor da célula; um exemplo seria a expressão do receptor CD4 para o vírus da AIDS. Uma idéia espetacular que começa a emergir a partir do nosso conhecimento da estrutura atômica e função de fatores de transcrição, é a possibilidade da síntese de drogas que inibiriam ou ativariam especificamente um dado fator de transcrição (Figura 47). Figura 46. Representação esquemática de estratégias usadas para produzir insulina para fins terapêuticos. Um outro exemplo da potencial aplicação da expressão de proteínas heterólogas em intervenção terapêutica seria a produção de grandes quantidades de anticorpos em plantas, visando seu uso em imunoterapia. As plantas são capazes de sintetizar e montar virtualmente qualquer tipo de molécula de anticorpo, desde fragmentos até cadeias completas e mesmo anticorpos multiméricos. Ma & Ben (1995) descreveram a expressão e montagem em plantas da molécula de IgA, que é a forma predominante de imunoglobulina em secreções de superfícies mucosas como o trato grastrointestinal. Até então a produção de IgA em sistemas heterólogos tinha sido frustante devido a complexidade desta molécula. Anticorpos produzidos em plantas podem vir a ser particularmente úteis para imunoterapia tópica. No caso, por exemplo, de cáries, Ma et al. (1990) mostraram que a aplicação tópica de anticorpos monoclonais contra uma proteína da superfície (de adesão) do Streptococcus mutans em dentes humanos conferiu proteção a longo prazo contra esse microrganismo em adultos. 45 B A Ala s s s s s s B A s s s s s s B A s s s s s s B A Thr s s s s s s B A s s s s s s B A s s s s s s B A s s s s s s B A E.coli E.coli E.coli levedura cadeia A cadeia B Pró-insulina Humana Precurssor de insulina Insulina humana (crb) Insulina humana (emp) Insulina suína Insulina suina pâncreas suíno Insulina bovina pâncreas bovino Insulina humana (prb) Insulina humana (pry) B A s s s s s s B A s s s s s s programas de análise que permitem a fácil visualização desses grupos e fornecem também a informação sobre o nível de expressão dos mesmos em cada uma das situações. Genes que são ativados ou reprimidos simultaneamente numa dada circunstância podem compartilhar funções, fazendo parte de uma mesma maquinaria multi-protéica ou atuando em processos celulares comuns. Esta é, portanto, uma abordagem de grande utilidade para o atual momento da ciência, a fase pós-genômica ou do genoma funcional. IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bristow, A.F. Recombinant-DNA-derived insulin analogues as potentially useful therapeutic agents. Trends in Biotechnology 11: 301-305, 1993. Bugg, C.E., Carson, W.M., and Montgomery, J.A. Drugs by Design. Scientific American 269: 60-66, 1994. Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. and Cesareni, G. J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991. Fields, S., and Song, O. Novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340: 245-246, 1989. Little, M., Fuchs, P., Breitling, F., and Dübel, S. Bacterial surface presentation of proteins and peptides: an alternative to phage technology? Trends in Biotechnology 11: 3-5, 1993. Luyten, W.H.M.L., and Leysen, J.E. Receptor cloning and heterologous expression--towards a new tool for drug discovery. Trends in Biotechnology, 11:247-254, 1993. Ma, J. K-C., and Hein, M. B. Immunotherapeutic potential of antibodies produced in plants. Trends in Biotechnology 13: 522-527, 1995. Ma, J. K-C., Hunjan, M., Smith, R., Kelly, C., and Lehner, T. An investigation into the mechanism of protection by local passive immunization with monoclonal antibodies against Streptococcus mutans. Infection and Immunity 58: 3407-3414, 1990. Monaco, A.P. AND Larin, Z. YACS, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends in Biotechnology 12: 280-86, 1994 Pausch, M. H. G-protein-coupled receptors in S. cerevisae: high-throughput screening assays for drug discovery. Trends in Biotechnology 15: 487-494, 1997. Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. 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