Fundamentos do desenvolvimento e da regulamentação dos fármacos

Fundamentos do desenvolvimento e da regulamentação dos fármacos

(Parte 2 de 4)

Química da descoberta

Biologia da descoberta

Química do desenvolvimento

Médica Toxicologia

Descoberta do fármacoDesenvolvimento do fármaco

Baseado no alvoBaseado no compostoOtimização do protótipo

Carcinogênese

Química do desenvolvimento

Digoxina

Morfina

Reserpina

Paclitaxel Penicillina G

QUADRO 48.1 Exemplos de Produtos Naturais Usados como Fármacos, suas Fontes e Usos

FÁRMACOUSO CLÍNICO E CAPÍTULO DE REFERÊNCIAFONTE CiclosporinaImunossupressor (Cap. 4)Beauveria nivea (fungo)

Antiarrítmico, inotrópico cardíaco (Caps. 18, 19, 24)

Digitalis lanata (dedaleira branca), Digitalis purpurea (dedaleira púrpura), muitas outras plantas

Analgésico (Cap. 16)Papaver somniferum (papoula)

Quimioterápico contra o câncer (Cap. 37) Taxus brevifolia (teixo do Pacífico)

Antibacteriano (Cap. 3)Penicillium chrysogenum (fungo) Anti-hipertensivo (Cap. 24)Rauwolfia serpentina (planta)

EstreptoquinaseTrombolítico (Cap. 2)Estreptococos beta-hemolíticos (bactérias)

As estruturas da estreptoquinase e da ciclosporina são complexas demais para serem incluídas neste quadro.

dopamina (ver Cap. 12), um dos primeiros tratamentos efetivos foi a administração de levodopa (L-DOPA), um precursor metabólico da dopamina. A insulina foi desenvolvida da mesma forma; após se descobrir que os sinais e sintomas de diabetes eram causados por baixos níveis de insulina, foi administrada insulina exógena como tratamento efetivo.

O agonista natural de um receptor também pode servir como arcabouço, que é submetido a modificações químicas. Essas mudanças podem alterar a afinidade de ligação, o efeito fisiológico (como a conversão de um agonista em um antagonista; ver Cap. 1), a distribuição, o metabolismo ou a farmacocinética. Essa técnica foi empregada no desenvolvimento da cimetidina (ver Cap. 42), um antagonista do receptor H2. Os pesquisadores fizeram sucessivas modificações no arcabouço estrutural da histamina para sintetizar um antagonista com alta afinidade pelo receptor e toxicidade reduzida. Da mesma forma, agora se usam insulinas modificadas com propriedades farmacocinéticas diferentes para tratar os pacientes com diabetes.

A probabilidade de sucesso da modificação de um agonista de molécula pequena é relativamente alta. Como o agonista natural tem atividade biológica, os derivados químicos daquele composto também tendem a apresentar atividade biológica. É claro que também pode haver problemas. A dopamina formada a partir da L-DOPA exógena pode ligar-se a receptores situados em áreas indesejáveis do encéfalo e causar alucinações. Além disso, muitas doenças não são mediadas pela interação de um agonista de molécula pequena e seu receptor. Muitos alvos para as moléculas de fármacos são canais iônicos ou proteínas que interagem com outras proteínas e, portanto, não são sensíveis a essa técnica de análogo do agonista.

Na conduta centrada no alvo para a descoberta de fármacos, os pesquisadores usam um alvo bioquímico ou molecular validado para pesquisa de compostos ativos. Essa ténica tem diversas vantagens. Primeira, se o alvo foi associado a um processo de doença, um composto ativo (hit) cuja interação com o alvo é bem-sucedida tem uma probabilidade relativamente alta de apresentar atividade farmacológica. Em segundo lugar, como o alvo é conhecido, pode ser mais fácil idealizar ensaios capazes de isolar o efeito do agente sobre o alvo. Isso ocorre principalmente nos processos patológicos complexos demais para serem observados em preparações de células ou tecidos. Por exemplo, embora possa ser difícil avaliar com rapidez o possível efeito de um fármaco no processo de aterosclerose, é relativamente fácil verificar se ele inibe uma enzima que faz parte da patogenia da aterosclerose, como a HMG-CoA redutase (ver Cap. 23). Com o avanço do conhecimento sobre a fisiopatologia das doenças, as condutas centradas no alvo para a descoberta de fármacos obtiveram cada vez mais êxito, e muitos novos fármacos foram descobertos usando métodos centrados no alvo. Os inibidores da protease do HIV, como o ritonavir, são exemplos notáveis de uma classe de fármacos descobertos usando uma conduta centrada no alvo. Em uma outra conduta, a dissecção da via biológica subjacente permitiu o desenvolvimento de macromoléculas, inclusive anticorpos, como novos fármacos para interromper a via (Boxe 48.1).

BOXE 48.1 Biologia e Terapêutica Macromolecular

As indústrias farmacêuticas e biotecnológicas estão se voltando cada vez mais para grandes moléculas, como peptídios, peptidomiméticos, proteínas, oligonucleotídios anti-senso e anticorpos monoclonais. As propriedades farmacológicas e a utilidade clínica dessas terapias são descritas no Cap. 53.

A conduta para a descoberta e o desenvolvimento dessas moléculas pode ser muito diferente da empregada com as moléculas pequenas. Considere, por exemplo, o desenvolvimento de agentes para o tratamento de doenças relacionadas à insuficiência ou ausência de um composto endógeno, como a insulina no diabetes, a eritropoietina na anemia, ou um fator da coagulação (fator VIII ou fator IX) em uma coagulopatia hereditária. Nessa situação, denominada terapia de reposição, não é necessário realizar análise extensa de um grande número de moléculas para verificar se é preciso modificar a molécula endógena. Portanto, esses agentes podem passar rapidamente às fases de desenvolvimento e teste em seres humanos.

Macromoléculas naturais ou modificadas são cada vez mais usadas, não apenas para substituir, mas também para modular processos fisiológicos, e macromoléculas criadas por engenharia genética, como anticorpos, estão sendo usadas no tratamento de doenças (Quadro 48.2). No caso de anticorpos, o processo de descoberta e desenvolvimento do fármaco pode incluir modificações que aumentam a afinidade ou a especificidade do anticorpo pelo alvo molecular desejado ou que “humanizam” o anticorpo para reduzir seu potencial imunogênico. Como em geral esses tipos de moléculas são administrados por via parenteral, a necessidade de selecionar propriedades farmacocinéticas aceitáveis é menor. Além disso, os necessários testes biológicos e de toxicidade em animais podem não ser tão extensos, porque o risco de toxicidade secundária (off-target) costuma ser menor com agentes biológicos. No entanto, a fabricação de um produto biológico pode ser mais difícil: os principais desafios são desenvolver um sistema capaz de produzir a macromolécula desejada em uma bactéria, fungo ou célula de mamífero e, depois, isolar o composto na forma pura em meio à grande mistura de produtos metabólicos que costumam resultar da síntese. A reprodução fiel dos procedimentos complexos associados à síntese e à purificação de macromoléculas torna o preparo de fármacos biológicos genéricos um grande desafio.

QUADRO 48.2 Exemplos de Terapias Macromoleculares

EritropoietinaAnemiaFator de crescimentoBactérias (recombinante humana) Estreptoquinase Trombolítico Proteína Estreptococos Heparina Anticoagulante Glicosaminoglicana Suína ou bovina Hormônio do crescimento humanoRetardo do crescimentoHormônioBactérias (recombinante humana) Hormônio paratireóideo Osteoporose Hormônio Bactérias (recombinante humana) Insulina Diabetes Hormônio Bactérias (recombinante humana) Soro antiofídicoMordida de cobraAnticorpoEqüino ou cultura celular

TrastuzumabeCâncerAnticorpoCultura de células de ovário de hamster chinês (anticorpo monoclonal humanizado)

Ensaio de Alto Desempenho (High-Throughput Screening)

A conduta centrada no alvo, mais simples, requer a rápida triagem de muitas moléculas usando um ensaio baseado no alvo do fármaco. O ensaio de alto desempenho usa análise baseada no alvo e automação robótica para testar milhares de compostos em poucos dias.

Existem dois aspectos fundamentais nessa conduta. Primeiro, deve haver uma grande coleção de compostos para triagem. Em segundo lugar, deve ser desenvolvido um ensaio eficaz que permita a rápida identificação de compostos ativos verdadeiros. O ensaio pode ser simples, como a determinação da afinidade de ligação dos candidatos a um receptor (ver Cap. 2), ou mais sofisticado, empregando manipulações bioquímicas ou celulares complexas. Em seguida, a biblioteca é submetida ao ensaio e qualquer composto com sinal positivo é examinado mais detalhadamente. Um ensaio realizado em microplaca de 96 ou 384 microcavidades permite a análise simultânea de muitos compostos. Além disso, após a criação de uma biblioteca de compostos, essa mesma biblioteca pode ser usada em muitos ensaios diferentes. A qualidade dos resultados depende da qualidade do ensaio e dos compostos na biblioteca; sendo assim, um ensaio mal elaborado ou uma biblioteca limitada podem resultar em falsos compostos ativos ou na negligência de candidatos viáveis. Na prática, como o ensaio de alto desempenho incentiva análises rápidas, resultados falso-positivos e falso-negativos não são raros. Mesmo quando se encontra um composto ativo (hit) verdadeiro, é provável que seja necessário aperfeiçoá-lo para aumentar a afinidade de ligação ou para modificar suas propriedades farmacológicas (especificidade, solubilidade, estabilidade, cinética, etc.); esse processo é chamado de “desenvolvimento composto ativo–protótipo” (hit-to-lead development).

Química Combinatória

Um aperfeiçoamento importante do processo de ensaio de alto desempenho foi a introdução da química combinatória. Em uma estratégia análoga à usada pela natureza para criar uma grande variedade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de aminoácidos (cerca de 20), a química combinatória usa um número relativamente pequeno de moléculas precursoras para criar um grande número de compostos. Os pesquisadores não estão limitados às substâncias naturais; em vez disso, geralmente usam um conjunto de precursores que têm grupos funcionais comuns e cadeias laterais divergentes. Por exemplo, um pesquisador que inicia com três conjuntos de 30 moléculas precursoras pode criar 27.0 (30 × 30 × 30) diferentes compostos em duas etapas de síntese (Fig. 48.3). Em teoria, seria possível criar cada composto individual em sua própria microcavidade de reação, mas na prática é mais fácil sintetizar as moléculas sobre um suporte sólido como uma esfera (bead) de poliestireno. Em uma síntese paralela, as esferas são divididas, de modo que milhares reajam juntas e, depois, sucessivamente recombinadas e divididas para sofrerem reações sucessivas. Essa estratégia reduz muito o número de reações na síntese (30 em lugar de 27.0 de cada vez, no exemplo anterior). No entanto, o desafio é separar as esferas para saber que substância foi sintetizada em cada uma. Os pesquisadores resolveram esse problema etiquetando cada uma com um código químico exclusivo, como uma seqüência de ribonucleotídio, durante cada reação. Para identificar uma esfera que tenha um composto ativo (hit) bem-sucedido, a etiqueta é clivada, amplificada por métodos padrões e seqüenciada. O código, então, revela a que reações a esfera foi exposta e, conseqüentemente, a identidade do composto bem-sucedido. Grandes quimiotecas podem ser sintetizadas dessa forma e, depois, submetidas a ensaios de alto desempenho para análise da atividade, às vezes com os compostos ainda ligados às esferas. O uso da química combinatória e do ensaio de alto desempenho é denominado conduta aleatória (shotgun approach), porque os pesquisadores testam às cegas uma grande variedade de compostos contra um único alvo. Essa conduta também pode ser modificada para pesquisa de um resultado específico utilizando “bibliotecas tendenciosas” para diferentes tipos de alvos. Por exemplo, os pesquisadores sintetizaram grandes bibliotecas de compostos com maior tendência a interagir com receptores acoplados à proteína G, enzimas proteolíticas, cinases ou canais iônicos, de acordo com as características estruturais de cada classe de alvo.

Planejamento de Fármacos Baseado na Estrutura

Outra conduta centrada no alvo é chamada de planejamento de fármacos baseado na estrutura ou planejamento racional de fármacos. Nessa conduta, um candidato a fármaco é descoberto usando a estrutura tridimensional do alvo determinada por meio de ressonância magnética nuclear (RMN) ou cristalografia de raios X. Teoricamente, os pesquisadores poderiam identificar o sítio ativo na estrutura do alvo, usar algoritmos de modelagem para estudar o formato do sítio ativo e criar a molécula de um candidato a fármaco que se adapte ao sítio ativo. Na maioria das vezes, porém, o alvo é co-cristalizado com um análogo do

Fig. 48.3 Diversidade através da química combinatória. A química combinatória usa substratos simples para produzir uma complexa biblioteca de compostos. Neste exemplo, o esqueleto funcionalizado (preto) tem múltiplos sítios de fixação. Dois monômeros (azuis) combinam-se ao esqueleto funcionalizado para produzir diversos produtos. Neste exemplo, dois grupos laterais diferentes para cada um dos monômeros formam quatro (2) produtos possíveis. As quimiotecas combinatórias usam vários substratos, cada um deles com 20 ou mais grupos laterais diferentes, e podem produzir milhares de moléculas complexas utilizando a mesma química básica.

substrato ou ligante do receptor (agonista ou antagonista) para identificar a estrutura do sítio ativo. Em seguida, a estrutura do análogo é modificada para aumentar a afinidade da molécula, como foi feito no caso do ritonavir (ver o caso no início deste capítulo). Outra opção é o aperfeiçoamento da estrutura de um novo composto que se liga ao alvo em um ensaio de triagem. A melhora repetida da adaptação da molécula protótipo ao sítio ativo do alvo aumenta a afinidade de ligação (Fig. 48.1).

A conduta de planejamento de fármaco baseada na estrutura tem diversas vantagens. Os compostos ativos aperfeiçoados (também chamados protótipos) costumam ser extremamente potentes, com afinidades de ligação na escala nanomolar. Além disso, é preciso testar apenas um número limitado de candidatos, porque é grande a probabilidade de que um ou mais dos compostos produzidos ligue-se ao alvo. Além disso, a modificação repetida do composto é relativamente direta, porque são conhecidas as partes da molécula necessárias para a ligação ao sítio ativo do alvo. Assim, em comparação com uma conduta em que não se conhece a estrutura, são produzidos menos análogos na conduta baseada na estrutura, mas cada análogo tem uma maior probabilidade de atividade. Uma desvantagem dessa conduta é que freqüentemente é mais difícil sintetizar os compostos modificados porque o modelo molecular requer funcionalidades específicas em locais específicos da molécula. Outra desvantagem é que pode ser difícil determinar a estrutura cristalina do alvo, sobretudo no caso de proteínas ligadas à membrana. Freqüentemente, outros métodos de planejamento de fármacos produzem análogos ativos muito antes de ser possível cristalizar o alvo. No entanto, mesmo que o composto ativo (hit) inicial seja produzido por outro método, muitas vezes pode ser aperfeiçoado em um protótipo usando planejamento baseado na estrutura.

Como ilustrado no caso introdutório, o planejamento racional de fármacos foi fundamental para o desenvolvimento de inibidores da protease do HIV como o ritonavir. Os métodos baseados na estrutura também foram usados para desenvolver uma segunda classe de fármacos antivirais, os inibidores da neuraminidase (ver Cap. 36). À medida que o planejamento de fármacos baseado na estrutura tornar-se viável, serão produzidos mais fármacos utilizando informações estruturais sobre o alvo mesmo que os análogos ativos iniciais sejam descobertos por outros métodos.

Em geral, o processo inicial de descoberta do fármaco identificará um grupo promissor de moléculas de protótipos que parecem interagir com o alvo de modo desejável. No entanto, muitas propriedades químicas, biológicas e farmacológicas dessas moléculas promissoras, que são atributos importantes de um fármaco efetivo, ainda são desconhecidas. A otimização do protótipo é a fase da descoberta do fármaco em que essas propriedades são caracterizadas e aperfeiçoadas, com o objetivo final de selecionar uma única molécula, que será submetida a testes clínicos e ao desenvolvimento formal do fármaco.

Na prática, a maioria dos protótipos tem uma ou mais características (p. ex., baixa solubilidade, baixa biodisponibilidade oral, metabolismo complexo, alta toxicidade) que as tornam candidatas inadequadas ao uso clínico. Usando os dados obtidos na otimização do protótipo, costuma ser possível modificar a estrutura da molécula para superar essas deficiências. Como exemplificado no caso introdutório, os precursores do ritonavir foram submetidos a várias modificações antes que se escolhesse um composto final para realizar ensaios clínicos.

Diversos fatores podem levar à exclusão de uma molécula na fase de otimização do protótipo. Estes incluem:

• Ineficácia em um modelo animal rigoroso da doença humana.

• Exposições sistêmicas inadequadas após administração oral (baixa disponibilidade).

• Metabolismo extenso ou complexo no corpo, resultando no surgimento de metabólitos reativos possivelmente perigosos.

• Solubilidade baixa demais, que impede o preparo de uma formulação adequada para administração.

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