Microscopia

Microscopia

MICROSCOPIA 1° Período/2009

  • Prof.ª Adriana L. de Oliveira Faria

Métodos de Estudo das Células Aula 2

Tecnologias de Análise

  • Objeto de estudo com tamanho reduzido

  • Requer técnicas especiais

  • Desenvolvimento de novas tecnologias e

  • equipamentos

  • – ex. fluorescência, microscópio confocal

  • MÉTODOS

  • • Observação -> MICROSCOPIA

  • – Preparação de amostras

  • • Detecção de componentes celulares

  • • Separação de componentes celulares

Tecnologias de Análise

  • MÉTODOS DE OBSERVAÇÃO

  • • Microscopia Óptica

  • • Microscopia Eletrônica

  • MÉTODOS DE DETECÇÃO

  • • Citoquímica

  • • Imunocitoquímica

  • • Radioautografia

  • MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

  • • Fracionamento Celular

  • • Cromatografia, Eletroforese,...

Preparação de amostras para estudo ao microscópio

  • Espécimens: células vivas ou fixadas

  • • Amostras fixadas - preservação dos componentes

  • • Evitar alterações pela técnica = artefatos

  • • ETAPAS DO PROCESSO:

  • 1. Fixação

  • 2. Microtomia

  • 3. Coloração

  • específicos para microscopia óptica ou eletrônica

Preparação de amostras para estudo ao microscópio

  • FIXAÇÃO

  • • evitar a autólise = degradação

  • • impedir a contaminação por bactérias

  • • endurecer células para o corte

  • • aumentar afinidade dos componentes por corantes

  • • tratamento com:

  • – microscopia óptica: formol e gluteraldeído

  • – microscopia eletrônica: tetróxido de ósmio e glutaraldeído (aldeído glutárico)

  • OBS.: interação com aminas de proteínas

Preparação de amostras para estudo ao microscópio

  • MICROTOMIA

  • • corte em fatias finas pelo MICRÓTOMO

  • • amostra incluída e protegida por matriz ou resina

  • – facilitar o corte e proteger tecido

  • • microscopia óptica: parafina ou resina plástica

  • – espessura 1 a 6 micrômetro (μm)

  • – micrótomo com navalha de aço

  • • microscopia eletrônica: resina dura tipo epóxi

  • – espessura 0,02 a 0,1 micrômetro (μm)

  • – micrótomo com navalha de vidro ou diamante

Micrótomo

Preparação de amostras para estudo ao microscópio

  • COLORAÇÃO

  • • constituintes celulares transparentes e incolores

  • • uso de corantes básicos ou ácidos específicos

  • • corante básico -> cromóforo catiônico

  • – colore componentes ácidos (aniônicos)

  • – componentes celulares: DNA, RNA

  • – ex. azul-de-toluidina, azul-de metileno, hematoxilina

  • • corante ácido -> cromóforo aniônico

  • – componentes básicos (catiônicos)

  • – constituinte celulares: algumas proteínas

  • – ex. orange-G, fucsina, eosina

Microscopia Óptica Comum com coloração

Limites de Resolução

Microscopia Óptica

Microscopia Óptica

  • • Ampliação total=

  • aumento da objetiva x aumento da ocular

  • • Poder resolução =

  • capacidade separar detalhes – ex.: ..

  • • Limite de Resolução (LR) =

  • função da objetiva, ocular apenas aumenta imagem

Tipos de microscopia óptica em função da luz

  • 1. Microscopia de Polarização

  • 2. Microscopia de Contraste de Fase

  • 3. Microscopia Confocal

  • 4. Microscopia Fluorescente

Microscopia de Polarização

  • • usa feixe de luz polarizado

  • • estruturas celulares separam feixe em planos

  • perpendiculares

  • – cristalinas ou moléculas alongadas

  • – anisotrópicas (birrefringentes) ou isotrópicas

  • • microscópio comum com dois prismas

  • polarizadores

  • – condensador - polarizador

  • – ocular - analisador

  • • visível apenas um plano (anisotrópico)

Microscopia de Contraste de Fase

  • • transforma diferenças de fase do feixe de luz em diferenças de intensidade

  • • velocidade da luz e índice de refração afetados

  • pela densidade de corpo

  • densidade = < velocidade e < índice de refração

  • • estruturas celulares com densidade diferentes

  • • diferença de fase -> dif. amplitude e intensidade

  • • uso em células vivas

  • • fase positiva e negativa

Microscopia Confocal

  • • tecidos/células tem > espessura que plano de foco

  • • focalização no micrométrico

  • • imagem de plano focalizado com menor nitidez

  • • causada por interferência do plano não focalizado

  • • Confocal -> iluminação a laser focada (varredura)

  • • = CORTE ÓPTICO!

  • • Utiliza compostos fluorescentes

Microscopia de Fluorescência

  • compostos fluorescentes:

  • • emitem luz de determinado comprimento de onda

  • • excitados por luz de certo comprimento de onda

  • • constituintes celulares: vitamina A, riboflavina

  • • corantes

Microscopia Eletrônica

  • • Capacidade de resolução limitada pelo

  • comprimento de onda empregado

  • • Óptico - limite = 0,2 μm

  • • Eletrônico - feixe de elétrons acelerados por

  • difereça de potencial 60 a 100.000 V

  • • Comprimento de onda = 0,005 nm

  • • Dois tipos básicos:

  • Microscopia Eletrônica de Transmissão

  • Microscopia Eletrônica de Varredura

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

  • • Geração de elétrons - cátodo de tungstênio

  • • Componentes paralelos ao microsc. óptico

  • • Bobina ou lente magnética (condensadora)

  • • Feixe de elétrons passa por objeto

  • • Bobina objetiva

  • • Bobina projetora: tela fluorescente (ZnS) e filme

  • fotográfico

  • • Trajeto de elétrons - vácuo (sem células vivas!)

  • • Desvio de elétrons geram imagem

  • • Componentes elétron-densos -> escuros

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

  • • Fornece imagens tridimensionais mas < resolução

  • • Imagens de superfícies

  • • Sistema análogo ao MET

  • • feixe delgado de elétrons com controle de diâmetro

  • • conjunto de bobinas defletoras controlam foco - varredura

  • • emissão de elétrons secundários

  • • colhidos por coletor e amplificados

  • • densidade de luz em monitor - fotografado

Métodos de Detcção

  • Citoquímica: localização intracelular de substâncias

  • • aplicada a MO e ME

  • • produto corado (MO) ou eletrón-denso (ME)

  • • reações específicas para componente

  • – DNA, RNA, proteínas, polissacarídeos, enzimas,...

  • Imunocitoquímica

  • Radioautografia

Imunocitoquímica

  • • localização intracelular de proteínas por reação

  • antígeno-anticorpo

  • • para organelas - usar proteínas específicas

  • – Ex. actina - citoesqueleto

  • • detecção direta ou indireta

  • • uso de marcação: peroxidase, fluorescência,

  • ferritina, ouro-coloidal+ptn A

  • • usadas em MO e ME

Imunocitoquímica deteção direta

Imunocitoquímica detecção indireta

Imunocitoquímica detecção indireta

Radioautografia:

  • • uso de radioisótiopos para localização intracelular de substâncias

  • • fornecimento de molécula marcada

  • – trício 3H, carbono 14C, enxofre 35S

  • • emulsão líquida - lâmina fotográfica

  • • exposição a filme autoradiográfico

Métodos de Separação

  • Fracionamento celular:

  • • fracionamento celular por centrifugação

  • • coeficiente de sedimentação função de tamanho, forma e densidade (sem sacarose)

  • • centrifugação fracionada - crescente

  • • centrifugação contra-gradiente

  • Cromatografia, Eletroforese, etc.

Centrifugação contra-gradiente

Métodos de Separação

  • Fracionamento celular:

  • Cromatografia

  • • Interação por troca iônica

  • – Catiônica ou aniônica

  • • Interação hridrofóbica

  • • Filtração em gel

  • • Interação por afinidade

  • Eletroforese

Cromatografia em coluna

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  • Junqueira, L.C., Carneiro,J. Biologia Celular e Molecular – 8ed – Rio de janeiro:Guanabara Koogan, 2005

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