Os vírus como causa deira alta e baixa em crianças:características geraise diagnóstico

Os vírus como causa deira alta e baixa em crianças:características geraise...

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SECCIÓN I91

Professora Mercedes C. Weissenbacher e Dra. María M. Ávila I. INTRODUÇÃO

As infecções respiratórias agudas (IRA) do trato respiratório inferior são uma das principais causas de mortalidade de crianças no mundo, particularmente nos países em desenvolvimento, causando aproximadamente um terço de todas mortes estimadas em crianças menores de 5 anos (1).

Entre os numerosos agentes etiológicos descritos, os vírus são reconhecidos como os agentes etiológicos predominantes nas IRA (2), tanto em crianças quanto em adultos, seja em países em desenvolvimento ou nos países industrializados (3).

Ainda que se postulasse que nos países em vias de desenvolvimento a etiologia bacteriana era a predominante nas IRA (4), em um estudo multicêntrico internacional coordenado pelo Board on Sciences and Technology for International Developmentda National Academy of Sciencesdos Estados Unidos, determinou-se que a etiologia viral está presente em maior proporção que a bacteriana (5), variando as porcentagens de identificação viral segundo o país entre 17 e 4% das IRA em crianças menores de 5 anos. Os vírus isolados mais freqüentemente foram o vírus sincicial respiratório (VSR), entre 1 e 37% do total dos casos estudados; o adenovírus, entre 1 e 7%, os parainfluenza 1 e 3, entre 1 e 1%; e os influenza A e B, entre 1,4 e 4,3% (6-9).

Demonstrou-se que o mesmo quadro clínico pode ser causado por diferentes agentes e o mesmo agente é capaz de causar uma ampla gama de síndromes. Os vírus mais comuns nas IRA altas são os rino e corona; e nas IRA baixas os influenza, parainfluenza, VSR e adenovírus (Quadro

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1). No entanto, outros vírus além dos mencionados podem causar afecções respiratórias altas ou baixas em crianças; entre eles pode-se mencionar o Herpes simplex,o Epstain-Barr (EBV), o vírus do sarampo e o da parotidite. A infecção viral pode causar por si mesma uma doença leve ou grave ou pode complicar-se favorecendo uma posterior infecção bacteriana (10). A pneumonia viral é mais comum que a pneumonia bacteriana, mas o risco de morte é consideravelmente menor (1).

O diagnóstico etiológico das infecções respiratórias virais é feito tradicionalmente mediante a detecção do agente etiológico durante a doença ou pela determinação de um aumento do título de anticorpos durante a convalescência. Tal diagnóstico é complexo devido à grande variedade de agentes que causam as IRA, mas foi simplificado grandemente com as metodologias existentes para a detecção direta do vírus no aspirado nasofaríngeo(12).

O isolamento em culturas celulares mais a identificação por técnicas imunoquímicas é considerado o método de eleição ou padrão para o diagnóstico virológico. Entretanto, é um método custoso e relativamente lento (às vezes leva mais de uma semana). Um encurtamento do tempo de obtenção de resultados da cultura viral foi obtido com a centrifugação a baixa velocidade das culturas celulares inoculadas com a amostra mais a identificação posterior por imunofluorescência.

A tecnologia tem avançado rapidamente no que concerne ao diagnóstico das infecções respiratórias virais, ainda mais que para as bacterianas, conduzindo ao desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico viral suficientemente rápidas, sensíveis e específicas. Além disso, como resultado do desenvolvimento de quimioterápicos antivirais como a amantadina contra influenza, o ribavirin contra o VSR e outros que estão em teste, faz-se cada dia mais necessário um diagnóstico etiológico acertado e rápido para o manejo do paciente.

Nos últimos anos foram desenvolvidos métodos de diagnóstico direto que permitem detectar em poucas horas a presença de vírus em amostras clínicas. Estes procedimentos são a imunofluorescência (IF), tanto direta como indireta; o imunoensaio enzimático (ELISA) de similar sensibilidade; o imunofluoroensaio de resolução por tempo (TR-FIA); a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a hibridação de ácidos nucléicos. Estes métodos podem dar um diagnóstico entre as 4 e 24 horas posteriores à extração da amostra.

Os métodos sorológicos de detecção de anticorpos antivirais não são os de eleição para o diagnóstico de infecções respiratórias devido à sua baixa sensibilidade e ao fato de que a resposta imune-humoral a estes vírus que não produzem viremia é, no geral, de escassa magnitude. Por outro lado, a necessidade de usar amostras pareadas de soro (ou seja, amostras do período agudo e do período de convalescência) faz com que o resultado não influa no controle terapêutico do paciente. De toda maneira, o diagnóstico sorológico é útil em estudos epidemiológicos, na avaliação de vacinas e em ensaios clínicos de novos antivirais, nos quais é importante detectar tanto infecções clínicas como subclínicas. Em geral, a técnica ELISA para detectar anticorpos IgG em soros pareados é um método sorológico mais sensível para diagnosticar as IRA de origem viral.

aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 92 a) Amostras clínicas para o diagnóstico

Para a obtenção de um diagnóstico acertado, é essencial a seleção adequada da amostra e sua correta extração, envio, conservação e processamento. Dado que a duração da excreção do vírus costuma ser breve, é importante recolher as amostras nos primeiros dias da doença. Uma amostra tardia pode levar a um resultado falso-negativo. Por outro lado, devido à relativa freqüência das infecções contraídas no hospital com estes vírus, a amostra no paciente hospitalizado deve ser obtida no momento da admissão, a fim de evitar o dilema de atribuir o vírus encontrado à doença que originou a hospitalização ou a uma infecção nosocomial.

O aspirado nasofaríngeo (ANF) é a amostra de eleição para identificação dos vírus causadores das IRA, já que provê um número apropriado de células infectadas. Os ANF são obtidos introduzindo uma sonda estéril nas fossas nasais do paciente, e usando uma bomba de vácuo ou seringa para realizar a aspiração da secreção nasofaríngea, que é colocada em um tubo cônico estéril. A amostra, fechada hermeticamente e em banho de gelo, é enviada ao laboratório de virologia para seu processamento. Não deve ser congelada.

Outras amostras que podem ser utilizadas são os lavados bronco-alveolares, nasais ou faríngeos.

Os raspados geralmente contêm menor número de células, o que os torna pouco apropriados para o diagnóstico. Ainda assim, pode-se utilizar em conjunto o raspado de fauces e o raspado nasal e desta maneira aumentar o seu rendimento.

b) Processamento das amostras

O objetivo de um bom processamento das amostras é otimizar o isolamento ou a identificação de qualquer vírus presente nas mesmas (Figura 1). Em primeiro lugar, procede-se a uma desagregação cuidadosa do muco. Para a detecção de antígenos virais pelo método ELISA ou de ácidos nucléicos virais pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou hibridação molecular, é conveniente a utilização do ANF sem centrifugar. Para detecção do vírus por imunofluorescência indireta (IF) ou por isolamento por culturas celulares, centrifuga-se a amostra a 4º C durante 10 a 15 minutos a 3.0 g (3.0 vezes a gravidade). O sobrenadante é utilizado para o isolamento viral em cultura de células. Por outro lado, as células no sedimento são lavadas e depositadas sobre porta-objetos que são fixados em acetona fria por 10 minutos e processados para IF.

A seguir, descrevem-se brevemente, em separado, os métodos mencionados para a identificação dos vírus que causam as IRA altas e baixas nas crianças.

b.1) Isolamento em culturas celulares

O uso deste método é recomendado quando está disponível no laboratório, já que é o método de eleição quando os possíveis agentes etiológicos são diversos vírus. As amostras devem ser mantidas entre 4º e 6º C, sem congelar. O material residual deve ser guardado fracionado a -70º C ou menos no caso em que se tenha que usar a amostra original de novo.

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Como se observa na figura 1, a técnica consiste em inocular uma alíquota1de 0,2 ml do sobrenadante do ANF nos distintos cultivos celulares em monocapa, os quais se tenha extraído previamente o meio de crescimento. Depois da inoculação, agrega-se o meio de conservação (sem soro fetal bovino e com agregado de tripsina nas células sensíveis ao crescimento de vírus influenza e parainfluenza) e incubam-se entre 34º e 35º C. As culturas devem ser observadas diariamente durante 1 dias para detectar o aparecimento de ação citopática (ACP) sobre a monocapa. Entre quatro a sete dias depois da infecção, para a detecção de vírus influenza e parainfluenza, realiza-se sobre culturas específicas (MDCK, LLC-MK2 e outras), uma hemadsorção (Had) com glóbulos vermelhos de cobaias. Aquelas culturas nas quais se observa ACP e/ou Had são processadas para a identificação do vírus por meio de IF. As culturas celulares primárias ou linhagens estabelecidas que permitem o isolamento dos distintos vírus respiratórios são numerosas e serão mencionadas mais adiante na descrição de cada vírus.

Obteve-se um aumento na infectividade viral e um encurtamento do tempo de obtenção dos resultados com a centrifugação a baixa velocidade das culturas celulares inoculadas com a amostra do paciente, o que aumenta a sensibilidade da cultura. Depois de uma incubação curta a fim de permitir a replicação, realiza-se o tingimento por IF para a identificação do agente viral presente. A combinação de ambas as técnicas demonstrou ter uma especificidade e sensibilidade equivalentes ao isolamento tradicional em culturas celulares em tubos, com uma redução no tempo de 10 para dois ou três dias (13-17).

b.2) Imunofluorescência (IF)

A IF, tanto direta quanto indireta, é uma técnica simples que permite a rápida identificação de numerosos vírus. Na prova direta, o soro antivírus específico é marcado com fluoresceína. Na prova indireta, faz-se reagir um soro específico contra o antígeno do vírus a detectar (produzido em animais) e logo se agrega um anticorpo dirigido contra a imunoglobulina da espécie animal empregada no passo anterior, marcado com fluoresceína.

A OMS coordenou estudos multicêntricos para o desenvolvimento e a utilização de anticorpos monoclonais no diagnóstico de IRA virais por IF. Foram realizados ensaios com kits de diagnóstico de IF em 16 laboratórios diferentes que demonstraram sua eficácia (18).

Atualmente, é possível obter os anti-soros específicos, policlonais ou monoclonais, para a identificação da maioria dos vírus respiratórios (19).Já foi demonstrado que as misturas de anticorpos monoclonais têm alta sensibilidade e especificidade para identificar antígenos virais em amostras clínicas, comparável a qualquer método de referência. Pode-se esperar uma perda mínima de sensibilidade quando são comparados com anticorpos policlonais de alta qualidade, mas os monoclonais permitem uma leitura mais simples e de qualidade muito superior (18).

1Uma parte ou proporção de algo.

aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 94 b.3) Ensaio imunoenzimático (ELISA)

Os métodos imunoenzimáticos para a identificação de vírus respiratórios têm sido desenvolvidos nos últimos anos com resultados variados e são utilizados para a detecção de antígenos em amostras clínicas. Emprega-se o princípio do sanduíche, agregando-se as amostras a tubos ou placas de plástico especial nos quais se fixou o anticorpo de “captura”, dirigido contra o antígeno que se busca. Em seguida agrega-se outro anticorpo específico contra o antígeno, mas marcado com uma enzima (as mais usadas são a peroxidase e a fosfatase alcaline). A atividade enzimática é detectada ao agregrar o substrato, por uma mudança de coloração que pode ser lida visualmente ou com um leitor de ELISA. Os anticorpos monoclonais melhoraram a sensibilidade e especificidade destes métodos e contribuíram para difundir o uso do ELISA como método de diagnóstico (20-23).Este método também pode ser utilizado para a detecção de anticorpos no soro.

b.4) Hibridação com sondas

Um enfoque diagnóstico mais recente está dirigido à detecção de genomas virais por hibridação com sondas de ácidos nucléicos específicos para a detecção de vírus. A sonda marcada é aplicada à amostra clínica e se existe uma cadeia complementar de ácido nucléico viral ocorre a hibridação que é detectada segundo o sistema de marcação empregado (sondas radioativas ou biotinizadas). Estas sondas podem ser preparadas por diferentes métodos que dependem fundamentalmente do vírus a ser investigado. Nos últimos tempos a tendência tem sido utilizar clones de ácidos nucléicos recombinantes ou oligonucleotídeos sintéticos que representem seqüências específicas do genoma viral de interesse (3, 24, 25).

b.5) Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Este método permite detectar quantidades muito pequenas de vírus, mediante a amplificação de seqüências do ácido desoxirribonucléico (DNA) genômico viral presente na amostra. O processo requer o uso de oligonucleotídeos complementares de seqüências genômicas conservadas do vírus denominadas primerse de uma enzima DNA polimerase termoestável. Como resultado da reação, são obtidas milhões de cópias a partir de uma única seqüência do DNA viral que logo podem ser detectadas a olho nu (por meio do tingimento com brometo de etídio) ou por meio de hibridação (radioativa ou enzimática). A utilização da mesma ainda é experimental, especialmente para o vírus da influenza, o VSR e o enterovírus (3).

b.6) Imunofluoroensaio de resolução por tempo (TR-FIA)

Este método, desenvolvido recentemente para a detecção de vírus respiratórios, é até o momento o ensaio em fase sólida mais sensível. Permitiu aumentar a sensibilidade da fluorescência ao eliminar a fluorescência inespecífica de fundo e conseguir uma

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Infecções respiratórias em crianças96 fluorescência de maior intensidade e tempo de queda com o uso de quelato de európio. Sua simplicidade e rapidez derivam do fato de que a amostra é incubada simultaneamente durante apenas uma hora, com o anticorpo de captura e o anticorpo específico marcado com o quelato de európio. O alto custo do equipamento requerido limitou seu uso aos laboratórios de referência (3).

Vírus da família Paramixoviridae, do gênero pneumovírus. O virião é pelomórfico, tem invólucro e seu diâmetro varia entre 150 e 300 nm (26).O ácido nucléico do VSR é uma cadeia simples de RNA de polaridade negativa. Não possui atividade de hemaglutinação, nem de hemadsorção, hemolítica ou neuraminidase. É muito sensível às mudanças de temperatura, o que deve ser levado em conta quando se pretende isolá-lo em culturas celulares. Até o momento, existe a descrição de um sorotipo de VSR e pelo menos duas variantes antigênicas ou subgrupos (A ou 1 e B ou 2). A maior diferença entre os subgrupos reside na glicoproteína G. Ambos circulam simultaneamente na população e não está clara a importância clínica ou epidemiológica destas variantes antigênicas (27-29). É provável que a diversidade antigênica dos dois subgrupos de VSR tenham alguma influência na susceptibilidade das crianças à infecção seqüencial com os mesmos. Em alguns países foram demonstrados recentemente padrões epidêmicos que alternam os subgrupos A e B em ciclos de 2 anos (3).

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