Filmes de agarose para separação eletroforética de proteínas e lipoproteínas. Somente para uso "in vitro".

180110 x 10 Determinações

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A análise do quadro protéico-plasmático é importante, pois se podem diagnosticar várias alterações patológicas. Entre os métodos de qualificação e quantificação dessas proteínas destaca-se a eletroforese, que se tem tornado um importante meio auxiliar de diagnóstico na maioria dos laboratórios clínicos. A eletroforese permite uma avaliação aproximada das concentrações de várias proteínas importantes, cujas alterações, seja de regulação de suas sínteses, ou de seu maior consumo, podem refletir nas suas mobilidades eletroforéticas ou nas suas concentrações.

Usar soro fresco livre de hemólise por até 3 dias mantidos em geladeira (2 a 8o C). O congelamento é desaconselhável.

1) Colocar 80 mL de * tampão tris pH 9,5 gelado (2 a 8o C) , na cuba.

2) Aplicar 0,4 µ µ µL de cada soro no filme de agarose.

3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincidindo os pólos negativos do filme com a cuba. 4) Colocar o porta-filme na cuba e tampá-la. Deixar por 20 minutos a 100 volts.

5) Retirar a tampa da cuba e o porta-filme, colocando-a sobre uma folha de papel de filtro para eliminar o excesso de tampão das bordas do filme. 6) Retirar o filme do porta-filme. 7) Mergulhar o filme em 200 mL de corante por 5 minutos sem agitação. 8) Retirar o filme do corante e colocar em 200 mL de descorante por 5 minutos.

9) Retirar o excesso de descorante do filme e colocá-lo a 60

C), até que o mesmo fique completamente seco. Sugerimos o uso de secador de cabelos com aquecimento. 10) Colocar o filme de agarose no descorante até o fundo ficar transparente. Se necessário, trocar o descorante.

C) novamente.

12) Ler no scanner ou no densitômetro à 520 nm. Pode-se ainda fazer a eluição das bandas com NaOH 2% (2 g NaOH em 100 mL H 2 O): recortar cada fração e colocar em 2 mL do eluente. Após a dissolução, ler a absorbância em 580 nm.

* Não reutilizar o tampão

Materiais necessários não fornecidos: Corante - Negro de Amido (Amido Black 10-B - art. 1810 - CELM) 0,1% em ácido acético a 5%. Descorante - ácido acético a 5%.

% g/dL

Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência. ILUSTRAÇÃO DA SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Nome: Paciente Frações%

Gráfico obtido no aparelho DS-35 Gráfico obtido no sistema SE-250

Observações

1. Em mulheres usuárias de contraceptivos orais e gestantes, os valores de albumina e gama-globulina apresentam-se ligeiramente inferiores aos intervalos apresentados. Pela mesma razão, as frações alfa-1- globulina, alfa-2-globulina e beta-globulina apresentam valores ligeiramente superiores aos intervalos citados (vide referência bibliográfica 2 no verso desta página).

Al. Amazonas, 764 - Alphaville - Barueri - SP - CEP 06454-070

INTRODUÇÃO As lipoproteínas do plasma sangüíneo são complexos macromoleculares constituídos de proteínas e lipídeos, como triglicerídeos, colesterol e seus ésteres. Pela técnica de eletroforese é possível separar quatro frações principais de lipoproteínas: quilomícrons, beta, pré-beta e alfa.

Usar soro fresco livre de hemólise, colhido em, no máximo, 12 horas. Deve-se evitar o congelamento da amostra, pois pode ocorrer degradação das lipoproteínas séricas, em especial se sua concentração estiver aumentada.

1) Colocar 90 mL de * tampão tris pH 9,5 gelado (2 a 8o C ), na cuba.

2) Aplicar 0,5 µ µ µL de cada soro ou plasma recém-colhido livre de hemólise no filme de agarose. Aguardar alguns segundos para que o soro penetre no filme e aplicar mais 0,5 µ µ µL de amostra.

3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincidindo os pólos negativos do filme com a cuba. Colocar o porta-filme na cuba e tampá-la. Deixar por 14 minutos a 100 volts. 4) Retirar a tampa e o porta-filme, colocando-o sobre uma folha de papel de filtro para eliminar o excesso de tampão das bordas do filme. 5) Retirar o filme do porta-filme.

6) Colocar o filme de agarose a 60

C), até que o mesmo fique completamente seco. Sugerimos o uso de secador de cabelos com aquecimento. Este procedimento deve ser realizado antes da coloração do filme. 7) Colocar o filme de agarose seco sobre uma folha de papel de filtro e, com o auxílio de uma pipeta, colocar sobre o filme de agarose 5 mL de corante solução trabalho. Não tocar a superfície da agarose com a ponta da pipeta. 8) Deixar corando de 2 a 3 minutos, até que o corante comece a precipitar e se torne azulado. 9) Mergulhar o filme de agarose no descorante (metanol 70%) até que o fundo se torne rosa claro (alguns segundos). 10) Retirar o filme de agarose do descorante e colocar numa solução de glicerol a 2% por 15 segundos, SEM AGITAÇÃO.

C) novamente.

12) Ler no scanner ou no densitômetro à 520 nm. Pode-se ainda fazer a eluição das bandas com água/metanol/acetato de etila (2,5 / 7,0 / 0, 5, v/v): dissolver cada uma das frações recortadas em 2 mL do eluente e ler a absorbância em 530 nm.

* Não reutilizar o tampão.

Materiais necessários não fornecidos: Corante - Fat Red 7 - B (art. 0775 - CELM) - 0,225 g/L em metanol p.a. (solução estoque). Solução trabalho - 10 mL da solução estoque + 2 mL de NaOH 0,1N Descorante - Metanol 70%

Alfa- 20,0 a 35,0 %
Pré-beta - 10,0 a 25,0 %
Beta- 45,0 a 65,0 %

VALORES DE REFERÊNCIA Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.

Frações%

Nome: Paciente

Gráfico obtido no aparelho DS-35 Gráfico obtido no sistema SE-250

1. Naoum, P.C. Eletroforese – Técnicas e Diagnósticos. 2a ed. São Paulo -

Livraria Santos Editora, 1999. 2. Rancharam, S., Sponzilli, E.E. e Wingerd, J.C. Serum protein fractions Effects of oral contraceptives and pregnancy. Obstet Gynecol,

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