PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA.ppt 2

PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA.ppt 2

PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA

  • Do grego, chroma, cor+ graphein, escrever.

  • Descoberta por Mikhail Tswett (1903).

  • Consiste, basicamente, em passar uma mistura de substâncias dissolvidas em um líquido (fase móvel) através de uma coluna, contendo uma matriz sólida e porosa (fase estacionária).

PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA

  • À medida que fluem através da coluna, as proteínas interagem com a fase estacionária, dependendo da natureza da interação: troca iônica, filtração ou afinidade.

TÉCNICAS DE SEPARAÇÃO

  • As proteínas são purificadas por procedimentos de fracionamento.

  • A idéia é eliminar seletivamente os demais componentes da mistura, de forma que somente a substância de interesse permaneça.

  • A purificação das proteínas é mais uma arte que uma ciência, pois obriga o analista a conhecer muito bem sua proteína-alvo, para conseqüentemente, escolher o melhor método de separação.

ESCOLHA DA TÉCNICA DE SEPARAÇÃO

  • PROPRIEDADE PROCEDIMENTO

  • * Carga * Cromatografia de

  • troca iônica e eletro

  • forese

  • *Tamanho * Cromatografia de

  • filtração em gel

  • * Ligação específica * Cromatografia por

  • afinidade

CROMATOGRAFIA

  • Introdução à purificação de proteínas

    • Era uma tarefa difícil devido às baixas concentrações
    • HEMOGLOBINA: altas concentrações, 1/3 da massa dos glóbulos vermelhos. A mais estudada.

CROMATOGRAFIA

  • 1º PASSO:

    • Removê-la da célulae e colocá-la em solução.
      • Moagem e esmagamento da célula que a contém
      • Detergente ou solvente orgânico que possa solubilizar
      • Hemolisante: rompe as hemáceas e libera a hemoglobina

ESTABILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS

  • Uma vez removida a proteína do seu ambiente natural, ela fica exposta a muitos agentes que podem danificá-la de forma irreversível.

    • pH
    • Temperatura
    • Enzimas degradativas ( proteases )
    • Adsorção às superfícies
    • Armazenamento por longo tempo

SOLUBILIDADE DAS PROTEÍNAS

  • Em razão de suas cargas elétricas, a solubilidade das proteínas depende da concentração de sais dissolvidos.

  • Sendo que tal solubilidade aumenta, à proporção que sais são adicionados. Contudo, decai se muito sal for adicionado.

  • Visto que as diferentes proteínas são precipitadas em diferentes concentrações de sal, a adição de sal é utilizada para separar (purificar) proteínas.

PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

  • Por precipitação, pode-se remover as proteínas indesejadas de uma mistura por meio do simples ajuste da concentração de sal;

  • Adiciona-se o sal até mais ou menos o ponto de precipitação da proteína a ser purificada;

  • Assim, após remover as proteínas indesejadas, a concentração de sal é aumentada ainda mais de forma a precipitar a proteína de interesse.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA DA CTI

  • As proteínas a serem separadas são dissolvidas em uma solução-tampão, contendo pH e concentração de sal apropriados;

  • Em seguida, são aplicadas na coluna, contendo o trocador de íons ( resinas);

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA DA CTI

  • Lava-se a coluna com solução tampão fraca para eluir (remover) as proteínas com pouca afinidade pelo trocador de íons;

  • Aplica-se um novo tampão forte, chamado eluidor, para remover a proteína de interesse, ligada à matriz;

CROMATOGRAFIA DE T. IÔNICA

  • Na C T I, as moléculas carregadas ligam-se aos grupos de carga de sinal contrário imobilizados na matriz;

  • Assim, os cátions ligam-se aos ânions e os ânions aos cátions;

  • Os principais trocadores de íons são:

    • Dietil-aminoetil (DEAE): trocador de ânions
    • Carboximetila (CM): trocador de cátions
    • Resinas: CELULOSE e AGAROSE

DOSAGEM DA Hb-G

  • A resina de troca iônica ( MATRIZ FIXA), carregada negativamente, exibe uma afinidade para moléculas positivas;

  • Em força iônica e pH selecionados, a hemoglobina glicada ( Hb-G), tem carga positiva menor que a Hb-A e se liga mais fracamente à resina;

  • A aplicação do tampão ( Hb-rápida ) promove a eluição da Hb-G, ficando as outras hemoglobinas retidas na coluna;

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