Biologia molecular

Biologia molecular

(Parte 1 de 3)

Acadêmicos:

Lenilson Vilela Hélio de Souza Júnior

Profª Draª Mônica

Sequenciamento de

DNA pelo método de

Sanger e pelo pirosequenciamento Biologia

Molecular

Básica

A unidade fundamental de informação nos seres vivos é o gene.

A compreensão de como a informação é armazenada e utilizada nas células tem representado um caminho para a solução de problemas relacionados à estrutura e função das células.

A geração de conhecimento em torno dos genes que compõem o genoma dos mais diversos seres vivos é possível por meio da determinação das sequências de nucleotídeos do DNA.

Definição

Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA.

Importância

O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutivacom outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).

Método de SANGER Método de SANGER

I -Reação de sequenciamento. É necessária a presença de desoxinucleotídeos, didesoxinucleotídeos terminadores marcados com fluoróforos, primers, TAQ polimerase e o DNA genômico.

I –Anelamento dos primers no DNA genônico e ligação da TAQ polimerase polimerizando aleatoriamente um deoxinucleotídeo ou dideoxinucelotídeo terminador de cadeia.

I –TAQ insere um dideoxinucleotideo terminador de cadeia marcado com um fluoróforo que não contem 3OH interrompendo a polimerização.

PrincípioPRINCÍPIO

IV –Criação de fragmentos de DNA clonados de tamanho aleatório.

V –Separação dos fragmentos em gel de poliacrilamida. A leitura das bases é realizada através do didesoxinucleotídeo terminador marcado com fluoróforo.

VI –Os diferentes fluoróforos são excitados emitindo comprimentos de onda em frequências diferentes captadas por um fotomultiplicador.

PrincípioPRINCÍPIO

Didesoxinucleotídeo (ddNTP) desoxinucleotídeo (dNTP) Didesoxinucleotídeo (ddNTP) desoxinucleotídeo (dNTP)

Método manual (Radioisótopos) (final da déc. 70);

Método automático (final da déc. 90 aos dias atuais).

Anelamento do primer Extensão do primer

Terminação da síntese: adição dos ddNTPs

Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante

Autorradiografia 32P

Esquema do Sequenciamento de DNA.

• Manual G A T C

Auto-radiogramas de um gel de seqüenciamento de DNA

Sequenciamento

Semi-Automático e Automático

Leitura Automático Maior avanço no seqüênciamento genético;

Uso de terminadores dideoxinucleotídeos com marcadores fluorescentes;

Os terminadores marcados quando estimulados por laser estimulam de forma específica um detector de fluorescência;

Softwaresespecíficos fazem a leitura à partir dos detectores.

denaturação anelamento dos primers

• Automática LEITURA DA SEQUÊNCIA DE DNA

Leitura Automático SEQUENCIAMENTO GENÉTICO

SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Sequenciamento Automático

• Seqüenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos, completamente automatizados;

• Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser;

• Eliminação da montagem da placa e preparação do gel;

• Aplicação das amostras por eletroinjeção;

• Alta velocidade e resolução na separação das amostras.

SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Capilares

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