Produção de celulase em cultivo de alta densidade - lnls

Produção de celulase em cultivo de alta densidade - lnls

(Parte 1 de 4)

19° Programa Bolsa de Verão - 2010

Projeto: Produção de celulase em cultivo de alta densidade celular utilizando Escherichia coli.

Bolsista de Verão: Bianca Consorti Bussamra

Orientadores: Sindelia Freitas Azzoni e José Geraldo da Cruz Pradella Campinas, fevereiro de 2010

Agradecimentos • Ao projeto Bolsa de Verão e ao CNPEM, pela grandiosa oportunidade.

• À coordenadora do projeto Bolsa de Verão, Ana Zeri.

• Ao grupo de trabalho do CTBE, pesquisadores, estagiários e funcionários.

• Aos meus orientadores, Sindelia Freitas Azzoni e José G. C. Pradella, pela dedicação, ensino e paciência durante o projeto.

• Ao Magno Oliveira, que me ajudou nesse período.

• Aos meus colegas bolsistas de Verão pelo companheirismo e amizades construídas.

• À minha família e amigos, pelo apoio.

• A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho.

Produção de celulase em cultivo de alta densidade celular utilizando Escherichia coli.

Resumo: A produção e o desenvolvimento de novas tecnologias de etanol de segunda geração estão avançando cada vez mais no Brasil, tendo-se em conta a abundante biomassa lignocelulósica, geralmente encontrada no bagaço da cana-de-açúcar. Essa biomassa pode ser utilizada como fonte de açúcares fermentescíveis, matéria-prima para a fermentação e obtenção do bioetanol. Entretanto, esses açúcares contidos no bagaço, principalmente a celulose e a hemicelulose, são de difícil acesso e precisam ser liberados. O desmantelamento da estrutura celulosehemicelulose-lignina, presente no bagaço de cana-de-açúcar, pode ser alcançado através de um ou mais processos de pré-tratamento para posterior utilização na etapa de hidrólise. Essa hidrólise pode ser realizada biologicamente por enzimas capazes de degradar a celulose, as chamadas celulases, especialmente as endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases, que atuam de forma sinérgica. O presente projeto teve como objetivo definir as melhores condições de produção de uma endoglucanase da família 5A, a fim de se obter um cultivo em alta densidade celular de Escherichia coli. Essas bactérias gram-negativas, que apresentam alta taxa de crescimento e metabolismo bem conhecido, expressaram a proteína recombinante intracelularmente utilizando vetores de expressão pET28A sob controle do operon-lac. Assim, para se descobrir as melhores condições de cultivo, diversos ensaios foram realizados. Obtevese, então, a concentração inicial de inoculo, sendo esta 5% v/v, tipo e concentração mínima de indutor, tempo de indução, fonte e concentração de carbono. O meio contendo 5g/L de glicerol apresentou a maior velocidade específica de crescimento. As análises se basearam na cinética de crescimento celular, consumo da fonte de carbono, síntese protéica e atividade celulolítica da enzima.

Resumoi
1. Introdução7
1.1 O álcool de segunda geração7
1.2 A celulose e a celulase na hidrólise enzimática7
1.3 A Escherichia coli usada como microorganismo na aplicação industrial9
1.4 Produção de celulase heteróloga a partir de Escherichia coli geneticamente modificada10
1.5 Cultivo de Escherichia coli em alta densidade celular12
1.6 O processo de fermentação descontínuo e descontínuo alimentado em biorreatores13
1.7 Impactos e aplicações da pesquisa em produção de celulase e objetivos do projeto15
2. Metodologia16
gene codificador da celulase16

2.1 Transformação Bacteriana – linhagem de células E. coli BL21 e plasmídeo pRT28-A contendo

codificador da celulase16
2.3 Cultivo celular17
2.4 Análise da cinética de crescimento através da densidade óptica (600 nm)17
2.5 Indução dos meios de cultivo e variação da fonte de carbono18
2.6 Análise de consumo da fonte de carbono - reagente DNS19
2.7 Detecção qualitativa e teste de expressão da enzima endoglucanase por SDS-PAGE19
2.8 Preparo do lisado celular para obtenção da enzima intracelular – Sonicação20
2.9 Quantificação de proteínas totais – Bradford20
2.10 Atividade enzimática com o substrato β-glucano21
2.1 Análise da atividade celulásica da enzima por PFU (Filter Paper Units)21
3. Resultados e discussões23

2.2 Preparo de banco de células BL21 transformadas com o plasmídeo pRT28-A contendo gene

de inoculo – 1%, 5% e 10%23

3.1 Curva de crescimento da Escherichia coli em meio complexo e definição da melhor concentração

proteína24

3.2 Definição do melhor tipo de indutor e sua concentração mínima para a expressão máxima da 3.3 Definição da melhor fonte e concentração de carbono do meio ao cultivo celular.......................32

anteriormente34
4. Conclusão36
4.1. Conclusão36
Anexos37
Anexo 137
Anexo 237

3.4 Avaliação do desempenho de cultivo em biorreatores aplicando os parâmetros definidos 1. Introduçã

Introdução

1.1. O álcool de segunda geração

No Brasil, a demanda por álcool combustível vem crescendo gradualmente. Devido às extensas áreas territoriais disponíveis para o plantio e altos investimentos na agricultura, atrelados às ótimas condições de clima e solo, o país se torna um excelente centro para o cultivo da cana-de-açúcar, principal matéria-prima para a obtenção de açúcares e produção do bioetanol.

A busca por novas tecnologias e a otimização da produção de combustíveis renováveis tem gerado significativa atenção e investimentos nessa área. Isso se deve a diversos fatores. Em primeiro lugar, a preocupação mundial com o aumento da temperatura, devido especialmente à constante emissão de gases do efeito estufa decorrente da queima de combustíveis fósseis, tem sido um fator primordial para o investimento nessa área de combustíveis renováveis. Além disso, o preço mais baixo do álcool em relação à gasolina e o aumento interno do consumo do álcool hidratado devido a introdução da tecnologia flex-fuel no mercado de veículos automotivos também impulsionam a produção de bioetanol. Diante esses aspectos, a produção mundial de etanol atingiu 36,5 bilhões de litros em 2006, dos quais 42,5% eram produzidos no Brasil. Assim, o país produz anualmente 21 bilhões de litros de etanol, utilizando apenas o caldo da cana-de-açúcar como matéria-prima. Desse processo, o bagaço da cana-de-açúcar é gerado como resíduo e utilizado pelas usinas e indústrias sucroalcooleiras como fonte de energia para aquecer as caldeiras. Entretanto, apenas 40% desse material é destinado a essa atividade, estando o restante, que atinge aproximadamente 140 Kg de bagaço/ton de cana-de-açúcar (DUARTE, 1989), apto para fornecer mais matéria-prima, na forma de carboidratos, para a fermentação e produção de bioetanol. Desse modo, a utilização da biomassa (bagaço) para a produção de álcool combustível envolve dois processos: a hidrólise dos polissacarídeos contidos na biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis e a produção do álcool através da fermentação destes.

1.2. A celulose e a celulase na hidrólise enzimática

As fibras lignocelulósicas da cana-de-açúcar são compostas principalmente de lignina, hemicelulose e celulose, constituindo a parede celular do vegetal. Na biomassa fibrosa, ou bagaço, esses três componentes são dispostos pelas seguintes proporções, respectivamente: 20,7 %, 25,2%, 46,6%, sendo os 7,5% restantes constituídos de cinzas e outros compostos. Após a extração do caldo, esse bagaço apresenta cerca de 45 a 50% de teor de umidade e um baixo teor de carbono fixo.

A celulose, principal componente estrutural da parede celular e, portanto, do bagaço, é também o mais abundante componente orgânico da Terra. A cadeia desse oligossacarídeo é longa e não ramificada, sendo constituída de subunidades de D-glucose ligadas linearmente por ligações glicosídicas β-1,4, como mostra a figura abaixo.

Figura n - Unidades de glicose na celulose. (Fonte: LEHNINGER, 1984)

A dificuldade da ação enzimática e quebra das moléculas de celulose deve-se a forma cristalizada em que se encontra. Esse arranjo estrutural altamente ordenado mantém as cadeias fortemente compactadas, dificultando o acesso da água a essa região, o que a torna insolúvel a esse solvente universal. Há algumas regiões da celulose menos compactadas, que são denominadas amorfas, constituindo apenas 15% da molécula.

O composto lignocelulósico é disposto de uma forma bem ordenada e compactada. As fibrilas de celulose são agrupadas a microfibrilas, e estas, por sua vez, são envolvidas por moléculas de hemicelulose. Essas estruturas são revestidas por uma camada de lignina por ligações cruzadas.

Devido a essa alta organização estrutural da matéria lignocelulósica, é imprescindível o pré-tratamento desse material para sua utilização como matéria-prima fornecedora de açúcares fermentescíveis, uma vez que visa a remoção da lignina e da hemicelulose, a diminuição da cristanilidade da celulose e o aumento da porosidade do material, de maneira a tornar a celulose susceptível a hidrólise. Esse pré-tratamento pode ser processado de diversos métodos: o físico (explosão a vapor), químico (ácidos, álcalis, solventes e gases) e o biológico (enzimas e fungos). Após esse pré-tratamento, o material lignocelulósico está apto para ser hidrolisado. Essa segunda etapa pode ser realizada através da hidrolise ácida ou enzimática. Dentre estes, o prétratamento a vapor tem sido descrito como um dos mais eficientes (NEGRO et al., 2003; SODERSTROM et al., 2003; MOSIER, 2005).

A hidrólise enzimática consiste na degradação das ligações químicas das moléculas, geralmente polissacarídeo, resultando em substâncias de tamanho menores, dissacarídeos (sacarose) e monossacarídeos (glicose-6C e xilose-5C), que possam ser utilizadas pelos microorganismos fermentadores. Tendo em vista que a celulose é um dos principais e mais abundantes polissacarídeo presente no bagaço da cana-de-açúcar, a utilização de uma enzima celulolítica ou um complexo enzimático celulilítico capaz de degradá-la em subunidades de cinco ou seis moléculas de carbono, como a glicose ou a xilose, resultaria em um processo de elevada relevância no que toca à composição da matriz energética brasileira. Perante isso, estudos têm sido realizados na busca dessas celulases capazes de hidrolisar a celulose de maneira cada vez mais efetiva, seja pela otimização de processos fermentativos, pela combinação de enzimas para a obtenção de complexos celulásicos mais eficientes ou pelo melhoramento de espécies produtoras dessas enzimas mediante aplicação de métodos de engenharia genética (JORGENSEN et al., 2004; IMAI et al.,2004). Outros estudos recentes, liderados por Paul Dupree, do Centro de Bioenergia Sustentável da Universidade de Cambridge (Reino Unido), se aplicam na área do estudo genômico da própria cana-de-açúcar, buscando encontrar os genes responsáveis pela produção do açúcar glucomanano, de fácil fermentação, e assim alterar a composição da parede celular da planta.

1.3. A Escherichia coli usada como microorganismo na aplicação industrial

A bactéria Escherichia coli é um dos microorganismos mais utilizados para a construção e amplificação de proteínas heterólogas. Isso se dá pelo fato dessa bactéria gramnegativa apresentar sistemas bem caracterizados em muitos aspectos e seu genoma já ter sido mapeado, além de não exigir condições de processos muito complexas e possuir baixo custo de cultivo. Entretanto, quando há aplicações onde a proteína recombinante é o produto de interesse, a produção extracelular dessa molécula é desejável por oferecer simples detecção e purificação, e um melhor meio livre de ação proteolítica (SHIN, CHEN, 2008). O fato da E. coli expressar a proteína intracelularmente se torna uma significativa barreira para seu uso nessa aplicação.

A produção de enzima por aerobiose geralmente apresenta uma quantidade de células geradas muito intensa em relação ao consumo de açúcar, e uma produção relativamente pequena da enzima. Além disso, o microorganismo selecionado deve apresentar tolerância ao acúmulo de produto no meio e a característica de não produzir substancias que sejam incompatíveis com o produto. Uma preocupação comum em relação ao cultivo celular é a produção e presença de proteases no meio, capazes de degradar a proteína de interesse gerada. Assim, as linhagens de E. coli comumente usadas na produção de proteínas possuem suas sequencias de produção dessas proteases previamente deletadas ou inibidas. A conversão do açúcar pode ser esquematizada a seguir(LEHNINGER, 1984):

Açúcar + O2 → células + CO2 + H2O + Intermediários + Produto (enzima)

A estabilidade quanto ao comportamento fisiológico é de grande importância quando se estima a produção em larga escala. As células produtoras devem apresentar valores

da expulsão do mesmo

heterogêneos ao longo da altura do reator em termos de pH e temperatura, ou seja, uma faixa de valores ótimos, uma vez que a manutenção e mudanças bruscas desses parâmetros se tornam inviáveis nessa escala de produção e meio de cultivo. A estabilidade genética também é essencial, uma vez que garante a passagem do plasmídeo às células filhas. Além disso, a estabilidade do plasmídeo no interior celular é de grande relevância, uma vez que células recombinantes podem ser instáveis em virtude da destruição do plasmídeo na própria célula ou

Outro ponto importante para o uso da E. coli é o fato dessa bactéria ser classificada com organismo de risco tipo 1, não expondo o homem e animais à patogenicidade e podendo ser cultivados em grandes quantidades em biorreatores, minimizando os riscos ambientais.

A presença de proteases nos meios de cultivo celular é um grande empecilho da produção de enzimas por microorganismo, uma vez que estas podem ser degradadas após sua síntese. Assim, linhagens de E. coli com deleção ou inibição dos genes codificantes de proteases são largamente utilizadas nos processos que visam a obtenção máxima da proteína de interesse.

O meio de cultura para o crescimento celular deve atender às necessidades nutricionais do microorganismo, ser ligeiramente tamponado para evitar variações drásticas de pH, ter composição razoavelmente fixa, não provocar problemas na recuperação do produto. Os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, para que possam estar disponíveis todo o tempo (SCHMIDELL, 2001). Geralmente, há dois tipos de meios, o sintético e o complexo.

O meio sintético apresenta suas concentrações fixas e composição química bem definida, e são compostos basicamente de fontes de carboidratos, nitrogênio, aminoácidos, fósforo e sais solúveis. Desse modo, o sistema produtivo celular se torna bem estável, e o processo de recuperação do produto final mais eficiente (BORZANI, 2006).

não homogeneidade do sistema produtivo celular (BORZANI, 2006)

O meio complexo é utilizado quando as características nutricionais do microorganismo são mal conhecidas e as linhagens necessitam de alguns fatores de crescimento. Materiais como extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte e peptona são adicionados para tornar o meio complexo. Esses fatores tornam o meio com uma composição variável ao longo do tempo de armazenagem, impedindo o estoque por grandes períodos de tempo e contribuindo para uma 1.4. Produção de celulase heteróloga a patir de Escherichia coli geneticamente modificada

A celulase, complexo enzimático constituído principalmente das enzimas endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases com função de catalisar a hidrólise da celulose, são produzidas essencialmente por fungos, bactérias e protozoários. A fim de tornar essa produção mais eficiente em relação a quantidade de produção e facilidade de acesso, essas proteínas podem ser produzidas de forma heteróloga. Isso significa introduzir o gene codificante da proteína em questão em um organismo geneticamente modificado, para este produzir a molécula como produto de seu próprio metabolismo.

Os sistemas de expressão bacterianos para produção de proteínas heterólogas são atrativos por causa de sua habilidade de rápido crescimento e alta densidade em substratos comuns e baratos (TERPE, 2006). Entretanto, a produção de proteínas recombinantes com alta pureza e bem caracterizadas é essencial para a produção em larga escala utilizando esse método. Além disso, é desejável que a proteína heteróloga seja solúvel, estável e não tóxica para a bactéria.

recosida seu caráter solúvel, e posterior renaturação para se tornar funcional

A tecnologia do DNA recombinante requer o conhecimento de mecanismos de expressão, também denominados promotores, e de repressão específicos do genoma do organismo hospedeiro. Um promotor adequado deve ser resistente, ter um nível de expressão basal baixo, para ser firmemente regulado, deve ser de fácil de transferência para outras cepas do microorganismo, a indução deve ser simples e ser independente dos ingredientes comumente usados no meio de cultura (TERPE, 2006). A inserção do gene a jusante de promotores fortes, tendo a sua regulação baseada na temperatura, geralmente acarreta em altas concentrações de produtos específicos. Entretanto, altas temperaturas podem estimular a formação de corpos de inclusão. Uma vez formados, o procedimento a ser feito é a desnaturação da proteína, para que

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