Relatorio 03 - Desnaturação e Precipitação de Proteínas

Relatorio 03 - Desnaturação e Precipitação de Proteínas

(Parte 1 de 2)

Universidade Federal do ABC

Transformações Bioquímicas

RELATÓRIO 03

Desnaturação e Precipitação de Proteínas

Caroline Delcole Borsolari

Diego Rodrigo Massa Monteiro

Henrique de Abreu Piccolo

Jucilaine dos Santos Pereira

Lidia Furukawa

Profº Jiri Borecky

Santo André

2009

SUMÁRIO

PÁGINA

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 3

2 OBJETIVO .............................................................................................................. 5

3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 6

3.1 Materiais ........................................................................................................... 6

3.2 Métodos ......................................................................................................... 6

3.2.1 Extração do suco de abacaxi ......................................................................... 6

3.2.2 Preparação da gelatina ................................................................................ 7

3.2.3 Ensaio 1 ........................................................................................................ 7

3.2.3 Ensaio 2 ......................................................................................................... 7

4 RESULTADOS ........................................................................................................ 8

4.1 Tabelas e fotos dos resultados ............................................................................. 8

4.2 O efeito do suco de abacaxi no colágeno ............................................................. 12

4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi ............................. 13

4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução ........... 13

4.5 Dificuldades técnicas ............................................................................................ 14

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 14

5.1 As proteoses do suco de abacaxi .......................................................................... 14

5.2 Purificação de proteínas ........................................................................................14

5.3 A otimização da atividade das proteases .............................................................. 14

5.4 O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de cozimento

dos alimentos .............................................................................................................. 15

5.5 A utilização do abacaxi para amaciar carne ..........................................................15

6 CONCLUSÃO.............................................................................................................15

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................16

1 INTRODUÇÃO

Proteases (ou enzimas proteolíticas) é um grupo de enzimas que catalisam a quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.

A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, 1984) sugeriram o uso do termo peptidase para um subconjunto de peptídeo-hidrolases (subclasse E.C 3.4). O termo protease é usado como sinônimo de peptidase. As peptidases compreendem dois grupos: endopeptidases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica e a eliminação do aminoácido seqüencial do terminal N ou C. A Figura 1 mostra o esquema de nomenclatura das proteases. O termo proteinase também pode ser usado para endopeptidase [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

FIGURA 1: Esquema de nomenclatura moderna de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

Endopeptidases

Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. A presença de grupos a-amino ou a- carboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima.

As endopeptidases podem ser subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22), aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24).

Exopeptidases

As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo (peptidil-dipeptidases). Algumas exopeptidases são específicas para dipeptídeos (dipeptidases) ou removem resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou ligados por ligações isopeptídicas. Ligações isopeptídicas são ligações peptídicas diferentes daquelas entre uma a-carboxila e um a-amino grupo, e estes tipos de enzimas são denominados omega peptidases.

Fontes

Proteases podem ser obtidas das plantas, animais e microorganismos. Proteases produzidas das plantas incluem a papaína, bromelina, queratinase e ficina. A papaina é extraída do mamão (Carica papaya). A bromelina é extraída do caule e frutos do abacaxi e a ficina é obtida do látex da figueira (Ficus glabrata). Essas três proteases têm especificidades similares, apesar de serem obtidas em diferentes fontes. Alguns grupos de plantas botânicas produzem queratinase, que pode degradar o cabelo.

Alguns exemplos de proteases produzidas por animais são protaminase, tripsina, quimotripsina, pepsina e renina. A protaminase é isolada de pâncreas bovino, leões marinhos e porcos, enquanto a tripsina e a quimotripsina são sintetizadas no pâncreas e secretadas na forma de zimogênio (tripsinogênio e quimotripsinogênio, respectivamente). A pepsina pode ser obtida a partir de células da mucosa gástrica de porcos, e a renina, do estomago de carneiros [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

Aplicação das Proteases

Proteases têm grandes aplicações industriais, principalmente nas indústrias de comida, detergentes, medicina e biotecnologia. Muitas proteases bacterianas foram purificadas, classificadas e comercializadas. Na indústria alimentícia, por exemplo, a aplicação das proteases inclui a produção de queijos, solubilização de pasta de peixe e amaciamento de carnes. Além disso, as proteases também são muito utilizadas no tratamento do couro em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então utilizados. Pelos aspectos econômicos e tecnológicos, as proteases bacterianas são as enzimas industriais mais utilizadas, com grandes aplicações em várias indústrias, como detergente, couro, seda, pão, carnes e cervejarias. As proteases englobam 60% da venda internacional de enzimas, sendo a enzima de detergente a maior usuária de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

As proteases também estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínas durante a ativação de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas secretórias na membrana.

Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição.

2 OBJETIVO

Mostrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturação protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica e conseqüente precipitação provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução de gelatina (colágeno).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

  • 8 tubos de ensaio de 20 mL

  • 1 tubo de ensaio de 30 mL

  • Pegador de tubo de ensaio

  • Estande para tubo de ensaio

  • Béquer de 100mL da Laborglás

  • Béquer de 400mL da Laborglás

  • Béquer de 20mL da Laborglás

  • Funil de vidro

  • Papel de filtro

  • Gelo

  • Almofariz e pistilo

  • 2 pipetas graduadas de 5mL

  • Bastão de vidro

  • Pera

  • Balança

  • Estufa

  • H2O destilada

  • Solução de Sulfato de Amônio 3mol/L

  • Etanol

  • Abacaxi

  • Gelatina incolor sem sabor

3.2 Métodos

3.2.1 Parte 1 – Extração do suco de abacaxi

Macerou-se os pedaços de abacaxi com o auxílio do almofariz e do pistilo, até que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro com papel de filtro dentro de um tubo de ensaio de 20mL que se encontrava em um béquer com gelo para que fosse mantida as propriedades do suco de abacaxi.

3.2.2 Parte 2 – Preparação da gelatina

Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor e dissolveu em 20mL de água destilada em um béquer com a ajuda do bastão de vidro. Após total solubilização a gelatina derretida foi transferida para um tubo de 20mL e levada à estufa de banho maria à 60°C. A gelatina ficou na estufa até o momento da sua utilização.

3.2.3 Parte 3 – Ensaio 1

Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi obtido na parte 1 do experimento em três tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de água em um tubo de ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi e o de água foram mantidos à temperatura ambiente, os outros dois foram aquecidos, ao mesmo tempo, um à 60ºC e o outro à 100°C durante 5 minutos. Após esse tempo os dois tubos foram resfriados imediatamente no béquer com gelo. Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e adicionou-se 2mL em cada um dos quatro tubos. Armazenou-se os 4 tubos à 37°C por 10 minutos. Após o tempo resfriou-se as amostras no béquer com gelo por 15 minutos. As amostras foram observadas e os resultados anotados.

3.2.4 Parte 4 – Ensaio 2

(Parte 1 de 2)

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