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  1. INTRODUÇÃO

A Glucose Oxidase (GOD) é uma enzima que tem como fontes microbianas os fungos Aspergillus niger, Penicillium notatum, Penicillium glaucum, Penicillium amagasakiense, e Penicillium purpurogenum, mas a sua principal fonte de obtenção é o fungo Aspergillus niger. É obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da produção de gluconato. [5]

Estruturalmente falando, trata-se de uma glicoproteína dimérica constituída por duas cadeias de polipeptídios idênticas que são ligadas covalentemente por pontes de sulfeto. Seu peso molecular varia de aproximadamente 130 a 175 KDa. É altamente específica a D-glucose mas, apresenta baixa atividade quando o 2-deoxi-D-glucose, D-manose e a D-galactose são utilizados como substratos. Sua atividade também é inibida pelos íons Ag +,Hg2 e Cu2. [13]

Catalisa a reação de oxidação β-D-glucose para a β-D-gluco-lactona utilizando oxigênio molecular como aceptor de elétrons e produz simultaneamente peróxido de hidrogênio (H2O2) o qual mais tarde, pela ação de uma catalase, produzirá água e oxigênio. Logos após, sem intervenção enzimática, ocorre uma hidrolise espontânea que transforma o β-D-gluco-lactona em ácido glucônico. [9]; [15]

O local onde esta enzima é produzida foi um ponto de discussão por muito tempo. Hoje sabe-se que ela é produzida tanto no meio intracelular quanto no meio extracelular, e que ambas contribuem para a produção de ácido glucônico. [8]

A produção de GOD é aumentada em ambientes com alta concentração de oxigênio e glicose porém, estudos mostram que nenhuma quantidade desta enzima pode ser obtida em ambientes onde a concentração de oxigênio dissolvido é menor que 7%. No entanto, estão sendo realizadas várias pesquisas com o objetivo de optimizar a produção de GOD através da utilização de cepas mutantes de Aspergillus niger. Nestes casos, há possibilidade de haver formação da enzima mesmo em concentrações de oxigênio inferiores a 7%. [8];[11]

Existem três maneiras para se expressar a atividade dessa enzima:

  1. Unidade Manométrica: 1 GOU (“glucoseoxidase Unit”) que representa a quantidade de enzima que promove o consumo de 10mm3 de O2 por minuto.

  2. Unidade Colorimétrica: 1 BU (“Boehringer Unit”) que representa a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 01 micromol de glicose por minuto.

  3. Katal: que representa a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 01 mol de substrato por segundo. [1]

O peso molecular da enzima obtida pelo Aspergillus Niger é de 192.000 GOU/mL ou grama, e sua temperatura ótima de crescimento está entre 30 e 50ºC, e o pH considerado ótimo está entre 4,5 e 6,5. [1]

A Glucose Oxidase é uma enzima de grande interesse e importância para as indústrias alimentícias, farmacêuticas e em pesquisas científicas. É utilizada em análises clínicas como principal reagente para a determinação dos níveis de glicose sanguínea devido ao seu custo relativamente baixo e a sua boa estabilidade. [1]; [13]

Entre seus vários usos na indústria alimentícia, a GOD é empregada como antioxidante evitando alterações de cor e sabor dos alimentos devido à presença de O2. É usado na produção de refrigerantes cítricos, refrigerantes em lata, cervejas e na maionese. Tem sido usada, satisfatoriamente, para remover resíduos de glicose e oxigênio em alimentos, com o objetivo de aumentar a sua vida de prateleira. O peróxido de hidrogênio produzido pela enzima atua como bactericida e pode ser removido posteriormente, usando uma outra enzima, a catalase, que transforma peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. [1];[11];[14]

Também tem grande importância na indústria de vinho, onde pode diminuir o teor alcoólico, pois é capaz de remover um pouco da glicose (pela conversão para δ-glucono-1, 5-lactona), a qual posteriormente seria convertida em álcool. Estudos mostram que vinhos tratados com glicose oxidase têm um teor alcoólico 2% menor. Além disso, essa enzima possui efeito bactericida, sendo assim, a necessidade de conservantes é menor. [13]

A glucose oxidase pode ser usada como anti-microbiano em produtos de higiene oral. A cavidade oral abriga várias espécies de estreptococos, como o Streptococcus mutans, que é um importante contribuinte para a cárie dentária. O H2O2 produzido pela glicose oxidase age como um útil bactericida. [13]

Neste trabalho, será abordado o processo de obtenção da enzima Glucose Oxidase, utilizando como fonte microbiana o fungo Aspergillus niger, realizado em prática no laboratório de biotecnologia, comparando e complementando os resultados obtidos com dados encontrados na literatura.

  1. MATERIAIS E MÉTODOS

O primeiro conjunto de operações desenvolvidas neste, e em qualquer outro processo biotecnológico industrial, é composto dos tratamentos iniciais (“upstream processes”), os quais antecedem a operação que será desenvolvida em um biorreator e tem a finalidade de colocar o sistema nas condições previamente estabelecidas para que o processo se desenvolva satisfatoriamente. [2]

    1. Escolha do Microorganismo

O início do processo de produção da Glucose Oxidase se dá pela seleção do microorganismo produtor, o qual pode ser obtido através de isolamento ou da aquisição junto a Coleções de Cultura. Neste caso, o microorganismo escolhido trata-se do fungo Aspergillus niger ATCC 1431.

    1. Preparo dos Meios e Esterilização

Como se sabe, os microorganismos utilizam como fonte de carbono, e freqüentemente de energia, diversos açúcares, tais como: glicose, sacarose, frutose, ou ainda polissacarídeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrogênio são freqüentemente utilizados sais, como o (NH4)2SO4, o (NH4)2 HPO4, ou aminoácidos, ou a uréia. Como fontes de fósforo utilizam-se os fosfatos solúveis, como o monoamônio fosfato, ou o diamônio fosfato, os quais passam a ser fontes de nitrogênio e fósforo simultaneamente. Ainda necessita-se adicionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co, etc., em concentrações freqüentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solúveis. [15]

Ainda, para uma grande variedade de linhagens, há a necessidade da adição de certos “fatores de crescimento”, ou seja, alguns aminoácidos específicos ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina, etc.) Como nem sempre é viável a adição dessas substancias puras, pode-se adicionar certos materiais mais complexos como: extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas), água de maceração de milho (“corn steep liquor”), farinhas diversas, etc. [15]

A seleção dos componentes de um meio irá depender das necessidades nutricionais do microorganismo escolhido, sendo também importante avaliar alguns outros fatores como, por exemplo, os custos e possíveis problemas que tal meio possa vir a causar no processo.

2.2.1. Meio de Ativação – Meio inclinado de PDA ou Agar Malte

Composição:

O preparo de 100 mL do meio foi realizado seguindo o cálculo:

Em um Erlenmeyer de 250 ml tarado, pesou-se 2,35 g do meio PDA em balança analítica (Marca: Labstore) e adicionou-se 150 ml de água destilada. O meio foi homogeneizado e levado ao forno de microondas (Marca: Panasonic) por aproximadamente 2 minutos, promovendo a fusão do meio PDA.

Foram distribuídos 15 ml do meio em 10 tubos de ensaio, fecharam-se os tubos com tampão de algodão e tampa metálica. Os tubos foram levados para um processo de autoclavação (Autoclave da marca: Lutis Ferrando Modelo 39.211) a 121°C por cerca de 20 minutos. Depois de retirados da autoclave, os tubos foram mantidos em banho-maria (Marca: FANEM, MOD.100) a cerca de 50ºC para permanecerem aquecidos até o seu uso. Os tubos foram retirados do banho-maria e mantidos em posição inclinada sobre a bancada até o seu resfriamento e solidificação total.

      1. Meio de Esporulação de Moyer et al.

Composição:

      1. Meio de Germinação de Moyer et al. – Meio de Propagação

Composição:

      1. Meio de Fermentação de Moyer et al., pH 6,0

Composição:

3. PREPARO DO INÓCULO

O primeiro passo foi transferir assepticamente uma alçada do microorganismo (Aspergillus niger ATCC 1431) de sua cultura de manutenção (ou cultura-estoque), usando-se uma alça de platina flambada e resfriada, para o meio inclinado de PDA para promover a ativação do microorganismo. O tubo foi incubado em estufa (FANEM LTDA. MOD.0023 n°304.323) a 25ºC por 72 horas.

Após ativação, transferiu-se, assepticamente em capela, uma alçada do inoculo do meio PDA para um frasco de Roux contendo o Meio de Moyer et al. para Esporulação, usando-se uma alça de platina flambada e resfriada e, incubou-se o frasco em estufa a 25ºC por 5 a 7 dias. Obs.: após 3 dias retirou-se da estufa e deixou-se temperatura ambiente em presença de luz. Frente a essas condições, houve a esporulação do fungo.

Depois da obtenção dos esporos, preparou-se uma suspensão dos mesmos. Para isso adicionou-se, assepticamente em capela, 20 ml de Tween-80 esterilizado ao frasco de Roux para se ressuspender os esporos e, filtrá-los em funil contendo gaze adaptado a um erlenmeyer, para separar os esporos contidos no filtrado dos micélios que ficaram retidos na gaze.

Preparou-se uma diluição de 3x com Tween-80 para dispersar os esporos e assim, realizar a contagem dos mesmos em Câmara de Neubauer (Marca: Improved Doppelt). Após homogeneizar bem a suspensão de células, preencheu-se a câmara, devidamente limpa e com lamínula aderida, com o auxílio de um capilar e procedeu-se a contagem no microscópio (Marca: Nikon, AL PHAPHOT – 2 YS2). Como o numero de células distribuídas pelo campo de visão encontrava-se elevado, procedeu-se a contagem utilizando a técnica de contagem de células em grande número na qual, conta-se apenas as células de 5 quadrados pequenos (4 em diagonal e um lateral), em 5 quadrados grandes totalizando 25 quadrados pequenos. (Ver figura 01 em anexo).

Determinou-se o número de esporos/ml do filtrado:

A soma da contagem realizada foi de 162 células e, utilizando o produto n x 16 x 104, temos que:

O resultado foi multiplicado por 3, devido as diluições realizadas então, o número de células/ml de filtrado é igual a:

Posteriormente, foi determinado o volume de suspensão de esporos a ser inoculado no Meio de Moyer et al. para germinação, de maneira que o número de esporos/ml estivesse na ordem de 6 x 106:

Foi inoculado 11, 54 ml da suspensão de esporos em Erlenmeyer de 250 ml contendo 150 ml do Meio de Moyer et al. para germinação e, icubou-se sob 28ºC e agitação constante em agitador rotatório Shaker (Marca: New Brunswick scientific – EDISON, N.J.,USA, série 25) a 200 r.p.m., durante 48 horas.

Após esse tempo, transferiu-se assepticamente o inoculo para um frasco de 2 litros contendo 250 ml do Meio de Moyer et al. para germinação e levou-se para incubação mantendo-se as mesmas condições de agitação e aeração da etapa anterior.

No dia seguinte, transferiu-se assepticamente o inoculo para um frasco de 2 litros contendo 500 ml do Meio de Moyer et al. para germinação levando-se para incubação nas mesmas condições de agitação e aeração das etapas anteriores.

Após esse ponto, procederam-se inoculações sucessivas, em volumes crescentes de inoculo e de meio. Essas inoculações sucessivas representam a etapa de propagação dos esporos e, são repetidas até a obtenção de volume de inoculo necessário para se iniciar a etapa de produção.

4. ETAPA DE PRODUÇÃO EM BIORREATOR

4.1. Esterilização do biorreator, equipamentos auxiliares e materiais

Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfície. Reatores bioquímicos e equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação são preferencialmente esterilizados por calor úmido. [15]

A esterilização por calor úmido de reatores de pequeno porte (até cerca de 30 L) e de vidrarias em outros materiais, inclusive meios de cultura, é em geral feita em autoclaves. A operação é simples, se o vapor é gerado internamente, a primeira providencia é completar o nível de água até a marca indicada pelo fabricante. Em seguida, o material ou equipamento a ser esterilizado é colocado na autoclave e a porta é fechada. O vapor gerado ocupa todo o espaço interno e expulsa todo o ar contido na autoclave e nos materiais e equipamentos presentes. Após a expulsão do ar a válvula de descarga é fechada para que a temperatura interna e a pressão alcancem a condição de esterilização (geralmente, 121ºC a 1 atm). [15]

A etapa de resfriamento inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento da entrada de vapor. A autoclave só deve ser aberta após a temperatura chegar próxima da ambiente, já que uma despressurizarão brusca pode provocar danos aos sensores colocados no interior dos reatores, como sondas de pH e de oxigênio dissolvido. [15]

Erlenmeyers com meio de cultura, pipetas graduadas, tubos de ensaio, etc., em geral são esterilizados por 15 a 30 minutos. Reatores necessitam uma esterilização por mais tempo (40 minutos a 1hora), já que não são agitados durante a esterilização e o seu centro demora para atingir a temperatura adequada. [15]

4.2. Montagem do Biorreator

Depois de limpar e esterilizar devidamente todo o material a ser utilizado na etapa de produção, acoplou-se os equipamentos auxiliares para a produção de Glucose Oxidase ao biorreator (Marca: Inceltech LH.SGI Discovery série 100):

- Acoplou-se o eletrodo de pH no interior do cilindro do biorreator e este foi ligado a um pHmetro (Marca: Micronal B474);

- Acoplou-se o eletrodo de oxigênio dissolvido no interior do cilindro do biorreator e este foi ligado ao medidor de tensão de oxigênio;

- Adaptou-se um frasco coletor de amostras ao tubo coletor através de mangueiras de silicone esterilizadas. As mangueiras estéreis foram conectadas a uma bomba peristáltica (Marca: Masterflex) e ao biorreator;

- Conectaram-se mangueiras estéreis também ao tubo de saída do ar para canalizá-lo até um frasco contendo água estéril para impedir a contaminação do meio de fermentação e do meio ambiente durante o processo de produção;

- Conectou-se o motor de agitação (Marca: INII Kron Brasil) contendo o eixo central com a hélice de agitação ao tacômetro (Marca: Appolikon ADI 1012) de modo a fornecer uma agitação de 200 r.p.m.. O tacômetro controla a velocidade de agitação das hélices;

- Conectou-se ao biorreator o conjunto de sistema de aeração de modo a ajustar uma aeração de 1,3 v.v.m.. Este conjunto compõe-se de um compressor de ar que comprime o ar atmosférico e o envia, através de canalização, até a sua saída onde um manômetro controla a vazão de ar comprimido a uma pressão adequada. O ar é direcionado até um rotâmetro que realiza a medida do volume de ar que entra por minuto no biorreator, antes, o ar deve passar através de um filtro de membrana que tornará esse ar ainda contaminado por microorganismos, em ar estéril que alimenta os microorganismos no biorreator;

- Para contribuir com a esterilização do ar, um purificador de ar foi ligado próximo do biorreator;

- E finalmente, foi acoplado o sistema de aquecimento do biorreator, neste caso composto por uma manta elétrica, a qual fez a manutenção de uma temperatura ótima de crescimento para o desenvolvimento do microorganismo.

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