Baixe Relatório de cromatografia de exclusão molecular e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica, somente na Docsity! Cromatografia de Exclusão Molecular data: 2010-11-16 Turma: 2 Grupo :2 Índice 1. Resumo................................................................................................................................ 3 2. Material e Métodos.............................................................................................................. 4 2.1 Montagem da coluna.................................................................................................... 5 2.2 Aplicação do azul de dextrano...................................................................................... 5 2.3 Aplicação das misturas padrão..................................................................................... 6 2.4 Aplicação da amostra desconhecida............................................................................. 7 3. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados........................................................8 2 Conclusão...........................................................................................................................16 3 Bibliografia........................................................................................................................ 17 Anexos................................................................................................................................... 18 Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 1 1. Resumo Este trabalho experimental teve como objectivo a ilustração da separação de uma mistura de proteínas globulares, recorrendo à cromatografia de exclusão molecular, também conhecida como filtração gel, determinando a massa molecular de uma proteína desconhecida, tendo por base o comportamento de uma amostra padrão. Como se verifica em todas as técnicas cromatográficas, recorremos à utilização de uma fase estacionária, neste caso o gel Sephacryl S-200-HR, o qual apresenta uma gama de fraccionamento de 5000 a 250000 para proteínas globulares, e uma fase móvel, o tampão Tris- HCl (pH 8,2) 50mM com NaCl 100mM. A separação é feita consoante o raio efectivo das moléculas, o raio de Stokes, e a velocidade de migração das partículas é tanto menor quanto menor for o seu tamanho, devido a uma maior penetração na rede de poros que constitui a fase estacionária. Inicialmente, para testar a homogeneidade do empacotamento da coluna e calcular o seu volume morto aplicou-se a amostra de azul de dextrano na coluna a um fluxo regulado a 1mL/ min e deixou-se eluir com tampão Tris-HCl (pH 8,2) 50 mM com NaCl 100 mM, recolhendo se fracções de 1mL de eluído + 2mL de tampão que foram então estudadas qualitativamente (cor) e quantitativamente, através da leitura de Abs620nm, permitindo traçar o espectro de absorção do azul de dextrano, λ =[250,750] nm, O volume morto obtido foi de 11,5mL. Em seguida, aplicou-se a mistura padrão, verificando-se que a albumina sérica bovina (BSA) elui primeiro, uma vez que tem maior massa molecular, 66 400 Da, penetrando menos no gel, seguindo-se a eluição da mioglobina, 16 900 Da, eluíndo por último o cromato de potássio, Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 2 4. Aplicação da amostra desconhecida Métodos 5. Traçado dos espectros de absorção no UV-Vis dos vários componentes analisados cromatograficamente Métodos Alteraçõs ao protocolo: O nosso grupo uma vez que não tinha bomba peristáltica trabalhou através da acção da gravidade para controlar o fluxo de tampão. A mistura padrão aplicada continha BSA, mioglobina e cromato de potássio, em vez dos componentes das misturas padrão A e B. As fracções colectadas foram todas de 1,5mL. 3. Apresentação, Tratamento e Discussão dos Resultados Na realização deste trabalho usou-se um Sephacryl S-200-HR, como já foi referido, e uma coluna com 42,8cm de altura e 1cm de diâmetro. Cálculo do volume V da coluna: cm3 sendo r o raio da coluna e h a altura da mesma. • Determinação do volume morto da coluna – azul dextrano Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 5 A cromatografia de exclusão molecular do azul de dextrano teve como objectivo determinar o volume morto da coluna cromatográfica já que este apresenta uma massa molecular relativa na ordem dos 2 000 000 Da, o que é superior ao limite de exclusão do gel utilizado e tem uma coloração azul. Deste modo, o azul de dextrano não penetra nos poros do gel, sendo eluído rapidamente e visivelmente e ainda possibilitando a determinação do volume morto da coluna. Na tabela abaixo encontram-se os valores das absorvâncias das várias fracções recolhidas nesta cromatografia. Fig.1 - Valores das absovâncias (a 280 e 620 nm) das várias fracções recolhidas aquando da eluição de azul de dextrano por cromatografia de exclusão molecular. Fracção Abs620nm Abs280nm Volume (mL) Coloração 1 0,008 0,032 1 Incolor 2 0,007 0,026 2 Incolor 3 0,003 0,018 3 Incolor 4 0,003 0,015 4 Incolor 5 0,003 0,012 5 Incolor 6 0,001 0,008 6 Incolor 7 0,001 0,008 7 Incolor 8 0,001 0,008 8 Incolor 9 0,005 0,012 9 Azul Claro 10 0,107 0,282 10 Azul Claro 11 0,663 1,774 11 Azul 12 0,683 1,338 12 Azul 13 0,087 0,229 13 Azul Claro 14 0,052 0,157 14 Azul Claro 15 0,034 0,093 15 Azul Muito Claro 16 0,025 0,078 16 Azul Muito Claro 17 0,029 0,106 17 Azul Muito Claro 18 0,028 0,101 18 Azul Muito Claro 19 0,026 0,068 19 Incolor 20 0,019 0,071 20 Incolor 21 0,016 0,050 21 Incolor Com base na fig. 1, construiu-se o cromatograma de eluição do composto (fig. 2) que relaciona as absorvâncias com os volumes recolhidos nas várias fracções e que nos dá o valor do volume de eluição do composto já que este corresponde ao valor de máxima absorvância (aos dois comprimentos de onda). Fig. 2- Cromatograma de eluição por exclusão molecular de azul de dextrano – Absrovâncias (a 280 e 620 nm) vs Volumes recolhidos. Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 6 Pelo cromatograma podemos determinar o volume morto da coluna, V0, já que: V0 = Ve Ve = 11,5 mL • Análise da amostra padrão Neste caso, a cromatografia efectuada teve como objectivo a calibração da coluna. Pode dizer-se mesmo que o resultado funciona como cromatograma de calibração, por analogia às curvas de calibração construídas para o mesmo fim, aquando de outras determinações quantitativas. Tal facto deve-se ao conhecimento dos componentes da solução padrão (BSA, Mioglobina e K2CrO4). Os valores das absorvâncias das várias fracções recolhidas foram registados na fig. 3, tendo em conta que os dois comprimentos de onda aos quais se realizou esta determinação (280 e 410 nm) foram escolhidos com base nas propriedades que os espectros de absorção dos constituintes da amostra apresentam. Mais pormenorizadamente, devido ao facto de conter resíduos de Tyr, Trp e Phe, a solução absorve no ultravioleta mas, também, por apresentar uma coloração castanha, absorve no visível. Fig.3 - Valores das absovâncias (a 280 e 410 nm) das várias fracções recolhidas aquando da eluição de uma solução padrão por cromatografia de exclusão molecular. Fracção Abs410nm Abs280nm Volume (mL) Coloração 1 0,010 0,042 1 Incolor 2 0,003 0,024 2 Incolor 3 0,006 0,033 3 Incolor 4 0,002 0,023 4 Incolor 5 0,001 0,019 5 Incolor 6 0,000 0,014 6 Incolor 7 0,000 0,015 7 Incolor 8 -0,001 0,016 8 Incolor 9 -0,002 0,013 9 Incolor 10 0,000 0,021 10 Incolor 11 0,016 0,251 11 Incolor 12 0,013 0,314 12 Incolor 13 0,009 0,246 13 Incolor 14 0,023 0,290 14 Incolor 15 0,066 0,109 15 Incolor 16 0,129 0,104 16 Incolor 17 0,303 0,120 17 Acastanhado Claro Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 7 24 0,017 24 Incolor 25 0,013 25 Incolor 26 0,010 26 Incolor Com base na fig. 6, e de modo a cumprir o objectivo deste ensaio, construiu-se também um cromatograma de eluição para a amostra desconhecida (fig. 7). Fig. 7 – Cromatograma de eluição por exclusão molecular da amostra desconhecida - Absorvância (a 410 nm) vs Volumes recolhidos. Fig. 8 – Cromatograma de eluição por exclusão molecular de azul de dextrano, de uma solução padrão e de uma solção de clara de ovo PCO1 – Absorvância (a 280, 410 e 620 nm) vs Volumes recolhidos. Como se pode observar no cromatograma obtido, o volume morto da coluna corresponde ao valor de volume, correspondente ao pico máximo de absorvência, 11,5mL, confirmando que o azul de dextrano eluíu no volume morto da coluna. Obteve-se também um volume de eluição de 14mL para o composto constituinte da amostra desconhecida, correspondendo a um pico de absorvência a 410nm. Uma vez que o volume de eluição da proteína constituinte da amostra desconhecida é próximo do volume de eluição da BSA (12mL), pode se afirmar que a proteína na amostra desconhecida possui uma massa molecular relativa, Mr, muito próxima da BSA. escolha dos comprimentos de onda para a determinação das absorvâncias teve como base os espectros de absorção de cada composto da solução padrão, do azul de dextrano, e amostra desconhecida, apresentados em anexo. Como podemos observar, os comprimentos de onda de máxima absorção são: Fig. 9 - Comprimento de onda de máxima absorção de cada composto da solução padrão. Composto λ de máxima absorção (nm) Azul de dextrano 259,0 / 617,0 BSA 277,5 Mioglobina 409,0 K2CrO4 273,5 / 372,5 Amostra Desconhecida 275,5 / 406,5 Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 10 Deste modo, a análise do azul de dextrano teve lugar a comprimentos de onda de 280 e 620 nm já que a amostra é constituída por dextrano derivatizado com um cromóforo azul, sendo que absorve melhor no ultravioleta e, como é colorida, também absorve no vísivel. Os comprimentos de onda a que foram determinadas as absorvâncias referentes às medições da solução padrão foram escolhidos com base no facto de todos os compostos absorverem no UV/Vis à excepção do BSA, que só absorve no UV. Finalmente, a análise das absorvâncias da amostra desconhecida foi realizada a 410 nm, na gama do visível, pois apresenta cor. Por último, vamos definir os valores de Kav para os diferentes constituintes da mistura padrão. Temos que: sendo: Ve – Volume de eluição de cada composto; Vo – Volume morto da coluna; Vt - Volume total da coluna. Como Vo foi determinado experimentalmente e Vt foi determinado directamente pelas medições da coluna, temos: Vt = 33,62 cm3 e Vo = 11,5 cm3 Logo: Fig. 10 - Quadro resumo do trabalho experimental. Composto / Mr (Da) Ve (mL) Kav λ màx absorção (nm) Azul de dextrano /2 000 000 11,50 0 259,0 BSA /66 400 12,00 0,17 277,5 Mioglobina /16 900 21,00 0,43 409,0 Dicromato de potássio /194 31,00 0,88 372,5 Amostra desconhecida 14,00 0,11 406,5 Podemos comparar os vários valores de Kav tendo em conta as massas moleculares dos vários compostos. Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 11 No caso do azul de dextrano, o valor de Kav igual zero já era de esperar visto que este composto apresenta uma massa molecular relativa ser superior ao limite de exclusão do gel o que fez com que a amostra de azul de dextrano se tivesse eluído mais rapidamente, não penetrando sequer nos poros, sendoo seu volume de eluição o volume morto da coluna. Relativamente ao BSA, à mioglobina e ao dicromato de potássio, os Kav são superiores a 0 e inferiores a 1 embora assumam valores muito distintos. No caso da amostra desconhecida, o valore de Kav faz crer que as moléculas do composto se encontram em maior percentagem no exterior do gel do que no interior das partículas deste, este facto deve-se a esta apresenta uma massa molecular relativamente grande. 2. Conclusão Através do método cromatográfico de exclusão molecular, baseada na velocidade de migração das partículas em função do raio de Stokes e da Mr das moléculas, procurou- se determinar a massa molecular de uma proteína desconhecida, tendo por base o comportamento de uma amostra padrão. Através do cálculo do volume morto (Vo=11,5mL) foi-nos possível estabelecer uma relação Kav entre os diferentes componentes e as suas respectivas Mr. Para o azul de dextrano, o valor de Kav igual zero coincide com o valor previsto, uma vez que este composto apresenta uma massa molecular relativa superior ao limite de exclusão do gel, para o BSA, mioglobina e dicromato de potássio, os Kav são superiores a 0 e inferiores a 1, assumindo valores muito distintos entre si devido às suas diferentes massas moleculares relativas. No caso da amostra desconhecida, o valorde Kav leva-nos a pensar que as moléculas do composto se encontram em maior percentagem no exterior do gel do que no interior das partículas deste, este facto deve-se a esta apresentar uma massa molecular relativamente grande. Uma vez que devido a alterações ao protocolo, na nossa mistura padrão apenas se verifica a presença de 3 compostos, não nos foi Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 12 Anexos Fig. 11 Espectro de absorção do azul de dextrano Fig. 12 Espectro de absorção da mioglobina Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 15 Fig. 13 Espectro de absorção do azul da BSA Fig. 14 Espectro de absorção de K2CrO4 Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 16 Fig. 15 Espectro de absorção da amostra desconhecida Bioquímica Experimental I 2010/2011 Página | 17