Baixe imunologia molecular e outras Notas de estudo em PDF para Biologia molecular, somente na Docsity! IMUNOLOGIA MOLECULAR” 1. Introdução. O sistema imune é composto por um conjunto de células hematopoiéticas e moléculas que se encontram na superficie destas células, ou que são secretadas transmitindo sinais entre as mesmas. O sistema apresenta uma atividade interna, constante, que é aumentada pelo contato com macromoléculas apresentadas em um “contexto de infecção”. O sistema imunitário dos vertebrados é uma vasta rede de moléculas e células com uma só meta: distinguir entre o que é próprio do indivíduo e o que não é. Sua função primária é de proteger os vertebrados contra microorganismos — vírus, bactérias e parasitas. Suas características de destaque são a especificidade, adaptação e a memória. Os elementos de reconhecimento da resposta imunitária humoral são as proteinas solúveis, chamadas anticorpos, produzidas pelas células plasmáticas. Na resposta imunitária celular, os linfócitos T atacam as células que apresentam padrões estranhos em sua superficie. Também estimulam a resposta humoral ao ajudar as células B, as precursoras das células plasmáticas. 2. Sistema imune. O sistema imune compreende dois sistemas, manifestados como imunidade celular ou imunidade humoral. O linfócito é a célula primária atuante em ambos os sistemas. A detecção dos vários marcadores imunológicos da membrana do linfócito, bem como suas características funcionais, permitiram a identificação de duas produções distintas de linfócitos: as células T e as células B. Os linfócitos T (células T) são derivados do timo ou influenciados pelo timo (timo-dependentes) durante seu desenvolvimento. As células T são responsáveis pela imunidade celular (isto é, processos imunológicos do tipo: reatividade cutânea retardada, rejeição aos aloenxertos, imunidade antitumor e defesa celular contra cogumelos, agentes parogênicos intracelulares e poxvirus). Os linfócitos (células B) desenvolvem-se na Bursa de Fabrício (Bursa-dependentes) nos pássaros e acredita-se que sejam derivados da medula óssea nos mamiferos. As células B são responsáveis pela imunidade humoral, que é * Seminário apresentado na disciplina Bioquímica do Tecido Animal (VET00036) do Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da UFRGS pela aluna LILIANE RUDNIK, no primeiro semestre de 2001. expressa pela produção de proteinas plasmáticas circulantes específicas, denominadas anticorpos. Após a apreensão a célula B que responde ao estímulo se alarga e começa a se dividir repetidamente. Após alguns dias, a progênie da célula original que responde ao estímulo gradualmente se diferencia em duas populações morfológicas e funcionalmente discretas. As células em uma destas populações adquirem a capacidade de produzir grandes quantidades de anticorpos e são chamadas plasmócitos. As células de outra população permanecem morfologicamente inalteradas e funcionam como células de memória. 3. Sítios de produção de anticorpos. O sistema imune nos mamíferos é composto por células pertencentes ao sistema hematopoiético. As células principalmente envolvidas na imunidade adaptativa são os linfócitos T e B, e os fagócitos mononucleares. Os anticorpos são produzidos nos tecidos linfóides secundários. Estes tecidos incluem não somente o baço e os linfonodos, mas também a medula óssea, as tonsilas e tecidos linfóides espalhados pelo corpo, principalmente nos tratos respiratórios, digestivo e urogenital. Embora seja dificil mensuração devido à maneira como está espalhada, a medula óssea é a maior massa de tecido linfóide secundário do organismo (Figura 1). Assim, se um antigeno é injetado por via intravenosa ele será capturado e estimulará a produção de anticorpos não somente no baço, mas também na medula. Apesar do baço produzir uma maior quantidade de anticorpos em relação ao seu tamanho, a medula óssea produz uma maior quantidade em número absoluto, ou seja, 70% dos anticorpos produzidos numa resposta a algum antígeno. Os tecidos linfóides do pulmão também contribuem significativamente na resposta imune contra antigenos injetados intravenosamente. Os antígenos administrado via oral, se conseguir penetrar na parede intestinal sem ser degradado, pode estimular os tecidos linfóides intestinais. A estimulação antigênica de uma parte do intestino pode provocar a produção de anticorpos na superficie do trato digestivo, bem como o pulmão, nas mamas e trato urogenital. A introdução direta de antígenos nas glândulas mamárias não-lactantes estimula a síntese local de anticorpos nos linfonodos destas glândulas e nos linfonodos para qual são drenados. Desta forma, encontram-se anticorpos em níveis relativamente altos no leite, durante a subsequente lactação. Y Na fase indutora, localizam-se na membrana de linfócitos B e agem como receptores antigênicos; Y Na fase efetora, são secretadas e como proteínas solúveis efetuam a remoção do antígeno. As imunoglobulinas devem: (a) ligar-se a antígenos, que compõem um universo imensamente variável, e (b) induzir sua remoção, através da execução de vários tipos de funções. 5. Classificação das imunoglobulinas. Todas as imunoglobulinas são proteínas, mas o conteúdo de carboidrato varia de 2-3% para IgG e 12-14% para IgM, IgD e IgE. Assim como outras proteinas, as moléculas de anticorpos podem ser classificadas fisioquimicamente com base em sua solubilidade nas soluções de sais fortes, carga eletrostática, peso molecular e estruturas antigênicas. 5.1 Imunoglobulina G. A IgG é a classe de imunoglobulina que aparece em maior concentração no soro (Tabela 1) e por esta razão desempenha um papel principal nos mecanismos de defesa dependentes de anticorpos. É uma imunoglobulina 7 S com peso molecular 180.000d e com determinantes antigênicos tipo y em suas cadeias pesadas (Figura 2). Devido ao seu tamanho relativamente pequeno, ela pode sair dos vasos sanguíneos mais facilmente que outras classes de imunoglobulinas e, por isso, participa prontamente na defesa dos espaços teciduais e superfícies corpóreas. A IgG pode opsonizar, aglutinar e precipitar antigenos, mas só ativa a cascata do complemento se houver acúmulo suficiente e numa configuração correta sobre a superficie do antígeno. Algumas subclasses de IgG ligam-se a mastócitos e por isso participam da hipersensibilidade do tipo T. Tabela 1. Níveis séricos de imunoglobulinas (mg/100 ml) em animais domésticos e no homem. Espécie IgG IgM IgA IgG(T) IgG(B) IgE Cavalo 1000 —- 1500 100 — 200 60-350 100-1500 10100 - Bovino 1700 — 2700 250 —- 400 10-50 - - - Cameiro 1700-2000 150-250 10-50 - - - Suíno 1700-2900 100-500 50— 500 - - - Cão 1000 — 2000 70- 270 20-150 - - 23-42 Galinha 300 — 700 120 — 700 30-60 - - - Homem 800 — 1600 50— 200 150 —-400 - - 0,002 — 0,05 Varieble region light chain Constant region light chain arieble region heavy chain Constant region heavy chain isulide bond Heavy chain Carboxy terminus cooH Figura 2 - Estrutura da imunoglobulina G. 5.2 Imunoglobulina M. A IgM é a imunoglobulina com a segunda maior concentração no soro da maioria dos animais. É uma molécula 19 S com peso molecular de 900.000 d, constituida por sete subunidades (Figura 3). Cada uma destas moléculas é estruturalmente similar à molécula básica de imunoglobulina em formato de Y, com a diferença de que possuem quatro e na três unidades homólogas CH e carrega determinantes antigenos tipo u. Os monômeros de IgM são ligados por ligação dissulfeto de uma maneira circular, formando uma estrela, e um pequeno polipeptídeo rico em cisteína, chamado cadeia J, liga duas das unidades. Moléculas de IgM são secretadas de maneira intacta pelos plasmócitos e a cadeia J deve ser, por isso, considerada como parte integrante desta molécula. IgM é a principal classe de imunoglobulina produzida numa resposta primária. É também produzida na resposta secundária, mas é sobrepujada pela maciça produção de IgG nesse tipo de resposta. Embora produzida em quantidades relativamente pequenas, as moléculas de IgM são consideravelmente são mais eficientes que as moléculas de IgG, seja na ativação do complemento, opsonização, neutralização de virus ou aglutinação. Devido seu grande tamanho, as moléculas de IgM estão basicamente confinadas ao sistema vascular e são, em decorrência disto, de menor importância de fluidos teciduais ou secreções do organismo. Monômeros de IgM também funcionam como receptores de antigenos na superficie das células B. Figura 3. Estrutura da imunoglobulina M. 5.3 Imunoglobulina A. A IgA é uma imunoglobulina rica em carboidratos de estrutura convencional. Ela tende a formar polímeros tais como dímeros 11 S, trimeros 13 S ou polímeros ainda maiores, além de achar também na forma básica 7 S (Figura 4). É a imunoglobulina com segunda maior concentração no soro humano, geralmente é a imunoglobulina de menor concentração nos soro de animais. Entretanto, a IgA é encontrada em secreções externas, e também de proteção do trato intestinal, respiratório e urogenital, úbere e olhos contra a invasão microbiana. Pode, porém aglutinar antigenos e neutralizar vírus. Sabe-se que seu principal modo de ação é a prevenção de aderência de antígenos às superfícies corpóreas. forem ligadas a macromoléculas. A macromolécula é no entanto, carreador do grupamento químico ligado, que é chamado de um determinante haptênico. A molécula estranha, pequena em si é chamada de hapteno. Os anticorpos induzidos por haptenos ligados reagem também com haptenos não ligados. Os animais podem fazer anticorpos específicos contra virtualmente qualquer grupamento químico. O grupamento dinitrofenila (DNP) é particularmente eficaz na indução de formação de anticorpos e, por isso, tem sido usado amplamente como determinante haptênico. As diversidades dos anticorpos são devidas: 1. múltiplos genes na linha germinativa; 2. mutação somática; 3. recombinação somática entre elementos formadores de um gene; 4. conversão gênica; 5. adição de nucleotídeos. Sabe-se agora que os mamíferos usam todos os cinco mecanismos para originar a diversidade. No entanto os tubarões, apresentam um grande número de genes para anticorpos, mas não usam recombinação somática, enquanto que as aves têm um pequeno número de genes para anticorpos que sofrem um nível muito alto de conversão gênica. LD 2 3 Antigen Microbe Pre Bcell Plasmacell Antibody ay de : Tsotype switch (6) ta Ro rf &s Lymphokinas o ed cs es “O 28,8, 8,008% Th, heiper cell Figura 6. Anticorpos na presença do antígeno. 6.1 Características dos antígenos. Os antígenos são convencionalmente definidos como macromoléculas com conformação diferente daquele das moléculas do organismo, e capazes de induzir uma resposta imune. Esta definição tem sido questionada recentemente, dando-se mais 10 ênfase ao contexto — infeccioso ou não — no qual uma molécula apresentada ao organismo que à sua “conformação de superficie”, como determinante da ocorrência ou não da resposta. Além disto, e mais importante, conforme esta visão alternativa o sistema imune deve ser visto como um sistema autônomo, cuja existência e funcionamento independem da presença do antígeno. Os antígenos podem ser classificados conforme vários critérios, tais como tamanho, forma, etc. Sua classificação é conforme o local de produção, assim: (a) antígenos endógenos, aqueles produzidos dentro de células do hospedeiro (virus, ou qualquer outro parasita intracelular), e (b) antígenos exógenos, produzidos fora das células do hospedeiro (bactérias, fungos, etc). O sistema imune reconhece partes da molécula, os epitopos ou determinantes antigênicos. A idéia tradicional de que a ligação antigeno-anticorpo (Ag-Ac) fosse análoga à de uma enzima com seu substrato — tipo “chave-fechadura” — não é aplicável a todos os anticorpos. Sabe-se hoje que antigenos protéicos nativos, por exemplo, podem interagir com sítios combinatórios mais planares. Entretanto, como a associação Ag-Ac é estabilizada por ligações não covalentes, os grupos que interagem devem estar bastante próximos para que estas forças se tornem significantes — isto é, o epitopo antigênico e o sítio combinatório devem ter estruturas complementares. Variações no grau desta complementaridade gera fenômenos que são estudados sob os termos de afinidade, avidez e especificidade. 7. Tolerância imunológica. A tolerância imunológica é um fenômeno pouco compreendido, definido operacionalmente pela inibição de resposta como resultado da interação de antígenos com receptores antigênicos nos linfócitos em condições nas quais os linfócitos não são ativados, mas ao invés disto mortos ou tornados não reativos. As duas situações em que este conceito é utilizado são a tolerância induzida a antígenos externos, e auto- tolerância. A tolerância pode ser induzida experimentalmente pela manipulação do estímulo. Determinadas formas, doses, frequência e vias de imunização favorecem a tolerância (respectivamente, proteinas desagregadas, doses muito baixas dadas frequentemente ou doses muito altas, e via endovenosa ou oral). Após a indução de tolerância, o organismo não faz resposta contra a mesma proteina, mesmo se fornecida do modo que normalmente induz resposta. 1 Os mecanismos que explicam este fenômeno são pouco conhecidos. Sabe-se que a tolerância é mais induzida em linfócitos B que T, e que dura menos tempo nesta primeira população. A tolerância ao próprio — isto é, o fato de que o sistema imune normal não agride o próprio — tem sido interpretada a partir dos resultados obtidos com a tolerância induzida. Os mecanismos mais comumente propostos são os de deleção clonal (morte dos linfócitos capazes de reconhecer proteinas próprias) e anergia clonal (inativação destas células). No entanto, evidências cada vez mais frequentemente apresentadas de que o sistema imune vê e interage com o próprio, possivelmente através de mecanismos como exposto na teoria da rede de Jeme, têm forçado a uma reconsideração destes modelos. É possível, na verdade que o sistema imune não apenas possa como também deva ver o próprio em várias situações, a fim de moldar o repertório de receptores com os quais interage com o meio ambiente. É importante observar que este modelo implica em que ver não é sinônimo de agredir, em situações normais, os componentes do sistema estão conectados entre si, em uma situação de equilíbrio; apenas quando um elemento — próprio ou não próprio — lhe for apresentado em um contexto de infecção (ainda pouco definido) haverá escape do equilíbrio e a montagem do que vemos como resposta imune. 8. Teorias da síntese das imunoglobulinas. As enzimas adquiriram suas especificidades em milhões de anos de evolução. Um anticorpo especifico aparece no soro de um animal em poucas semanas após a exposição a um determinante antigênico. A teoria instrutiva, que foi proposta por Linus Pauling em 1940, postulava que o antígeno agisse como um molde que orientasse o enovelamento de uma cadeia nascente de anticorpo. Nesse modelo, as moléculas de anticorpo com uma dada sequência de aminoácidos teriam o potencial de formar centros de combinação com muitas especificidades diferentes. O anticorpo dependeria do antigeno para ser enovelamento. Outra hipótese contrastante, chamada teoria seletiva (ou teoria de seleção clonal), foi proposta e desenvolvida por Macfarlane Burnet, Niels Jeme, David Talmage e Joshua Ledeberg, no ano de 1950. Postulava que o centro de combinação de uma molécula de anticorpo estaria completamente determinado antes mesmo que encontrasse o antigeno. Nessa teoria, o antígeno afetaria só a quantidade do anticorpo especifico produzido. 12 Genetic rearrangment Vgenes D-J genes Genetic rearrangment V-D-J genes Genetic rearrangmemt V-D-J genes Genetic rearrangment Genes K são encontrados em um dos cromossomos separados, e genes da cadeia À, estão localizados no terceiro cromossomo. Existe uma extensa variabilidade e tegiões constantes na mesma proteina sendo um grande problema aos geneticistas. Relembrando que um gene codifica uma proteina. Não existe uma maneira fácil para explicar como a codificação genética final para milhões de anticorpos, poderiam acumular no largo de várias mutações apresentando regiões variáveis, enquanto deixa outro final do gene não modificar. Isso leva a postular uma heresia, essa germinação em 15 linha contém separação de genes para duas regiões. Desde que isso tem-se verificado, exceto que foi conservado a proposta que existem sempre três genes para fazer cada cadeia leve e quatro para fazer a cadeia pesada. As regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve são codificadas para um único gene. A 1egião VH é codificada por genes escolhidos aleatoriamente de um total de 300 genes variáveis (vermelho). Somando-se a isso o VH contém um em torno de 15 genes diversos (laranja), quem o codifica são três aminoácidos e um de aproximadamente 8 junções de genes, que codifica em torno de 10 aminoácidos. Existem regiões não traduzidas de DNA entre cada grupo (em cinza). Durante o desenvelopamento somático os genes são rearranjados para trazer o gene V próximo do gene D e um gene J. O processamento do RNAm antes de deixar o núcleo, removendo essas regiões não codificadas e tanto a |t ou o essas regiões fixas. mANA tanscription mRNA transcription mRNA transcription 16 O mRNA deixa o núcleo, e entra no citoplasma onde se liga a um ribossomo, a sequência é traduzida. A tradução agora pode prosseguir, e a cadeia que está sendo sintetizada atravessa a membrana e penetra no retículo endoplasmático, separa-se formando o corpúsculo de Golgi onde a molécula é secretada para o exterior por pinacitose reversa. Durante uma resposta imune ao antígeno, uma adicional rearranjamento ocorre este removendo e intervindo o material que este entre VDL e a região constante de genes se alonga, com a variabilidade de números da região constante de genes. Esta é a maneira como as imunoglobulinas de outras classes são produzidas. mRNA processing production of Ig and IgD production of Ig ane IgD' due tis f prsdueton nm ? EM 17