Práticas de Biologia Celular

Práticas de Biologia Celular

(Parte 1 de 4)

Cristina Pacheco Soares Newton Soares da Silva

Considerações Gerais sobre a utilização do Laboratório01
Dimensões em Biologia, Instrumentos e Técnicas Usadas em Citologia04
Microscopia07
Observação do Microscópio Óptico Comum26
Utilização do Microscópio Óptico Comum30
Diversidade Celular31
Observação de Células Vegetais34
Dissociação do Epitélio da Mucosa Oral35
Observação dos Componentes em Célula Vegetal Viva36
Observação de Vacúolos e Leucoplastos38
Observação de Células de Elódea40
Movimento da Água Através da Membrana41
Prova da Permeabilidade Seletiva na Membrana43
Permeabilidade Diferencial em Células Vivas4
Observação de Estômatos47
Observação de Mitocôndrias em Células Vivas51
Classificação dos Cromossomos Humanos e Montagem de Cariótipo53
Simulação da 1ª Lei de Mendel57
Estudo dos Tecidos Animais59

SUMÁRIO Bibliografia Recomendada...............................................................................................60

Professores: Dr. NewtonSoares da Silva e Dra. Cristina Pacheco-Soares 1

Prof.:Data: ............/............./............

Considerações gerais sobre a utilização do laboratório a) Os horários de aula deverão ser obedecidos com rigor.

b) É aconselhável o uso de avental, pois além de proteger a roupa, condiciona o aluno à limpeza e disciplina.

c) O aluno que danificar o material permanente ou de consumo, mesmo casualmente, deverá indenizar a Escola, a critério do professor.

d) Não jogue lixo nas pias, mas em cestos apropriados e embrulhados em papel.

e) Não risque as bancadas. O aluno deverá encontrar seu lugar limpo e assim deixá-lo para o colega seguinte. Se observar algo errado comunique ao professor assim que chegar, pois o professor terá condições de localizar o grupo desordeiro. Limpe seu lugar quando terminar o trabalho.

f) Observe, ao sentar-se, se as torneiras de gás à frente estão fechadas e desobstruídas, pois qualquer alteração pode causar vazamento que você estará inspirando.

g) Não é permitida a passagem de alunos para o laboratório de microbiologia pelo interlab. Mude de sala pelo corredor de fora.

h) Você irá trabalhar em grupos formados sob seu critério. Portanto escolha bem seus companheiros de trabalho.

Como documentar o curso

Todo trabalho científico precisa ser documentado. No caso de Biologia o desenho esquemático é muito importante desde que seja realizado com honestidade, isto é, sem criações, sem a influência do esquema do professor, com atenção e sem pressa.

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1. Leia todo o roteiro da experiência que vai fazer, antes de iniciar o trabalho para ficar claro o que vai ser realizado.

2. Separe todo o material necessário antes de começar o trabalho.

3. Siga especificamente as indicações de tempo, material, etc. como o roteiro indica.

4. Após usar, coloque cada material no local indicado para não misturar componentes.

5. Só esquematize o que você de fato vê. Não dê asas a sua imaginação. Isto é um trabalho científico e não uma obra de arte. Se alguma estrutura deveria ser exibida e não aparece, anote o sucedido por escrito em seu roteiro, porém procure bem antes de proceder desta forma. A qualidade dos esquemas é importante para sua compreensão.

6. Leia o roteiro com atenção. Solicite auxílio do professor só em último caso.

7. Anote todos os dados. Na hora eles podem não parecer importantes, mas o serão para as conclusões.

8. Escreva em linguagem simples e clara e evitará enganos.

9. Não use lápis de cor ou similar, régua a menos que o roteiro instrua em contrário. Os desenhos serão feitos a lápis, a mão livre.

10. Coloque o nome, número e a turma a tinta e no lugar indicado. Não se esqueça que os relatórios são individuais.

1. Os esquemas devem ser acompanhados de legendas e explicações por escrito e eventualmente gráficos. Tudo que você desenhou tem nome.

12. Quando o roteiro solicitar que você faça o mesmo esquema com diferentes aumentos, note que os desenhos não terão tamanhos diferentes, terão detalhes a mais ou menos.

13. O roteiro foi programado para ser executado durante a aula. Habitue-se a trabalhar com regra e horário, pois caso você não termine, não poderá fazê-lo em casa, uma vez que você não dispõe do material necessário. Não passe a limpo, pois isso é o mesmo que copiar figuras e os esquemas devem partir do natural.

14. Lembre-se que o relatório deve estar correto e agradar aos olhos (esteticamente falando).

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Do seu desempenho e comportamento depende a sua nota de laboratório. Seja objetivo, consciente e responsável.

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Prof.:Data: ............/.............

Tema: DIMENSÕES EM BIOLOGIA, INSTRUMENTOS E TÉCNICAS USADOS EM CITOLOGIA, DIMENSÕES EM BIOLOGIA As dimensões das estruturas biológicas podem agrupar-se em dois grandes grupos, macroscópicas, isto é, visíveis ao olho humano e microscópicas, isto é, invisíveis ao olho humano, tendo como fronteira o poder de resolução do olho humano. As unidades de medida utilizadas nestas dimensões estão, assim, adaptadas sendo as mais freqüentemente utilizadas o micrômetro (µm) para a microscopia óptica e o nanômetro (nm) e o angstrom (Å) para a microscopia eletrônica. A sua relação com a unidade fundamental do sistema métrico, o metro (m) e com o milímetro (m) é a seguinte:

1 Å = 10 -10 m = 10 -7 m (0,0000001 m) Nesta disciplina iremos falar muito em especial do mundo microscópico e como tal face ás dimensões das estruturas celulares que, salvo raras exceções como é o caso da acetabulária, da gema do ovo e de alguns feixes líberos-lenhosos, são invisíveis ao olho humano, é por demais óbvio a necessidade de utilização do microscópio uma vez que o limite de resolução do olho humano é de 100 µm (0,1 m). Em termos de formação de imagem é fundamental percebermos o significado de três conceitos muito importantes, que são o poder de ampliação, o poder de resolução e o de limite de resolução. Poder de ampliação: capacidade de um aparelho aumentar n vezes uma imagem. Na microscopia é dado pelo produto entre a ampliação das oculares e a ampliação das objetivas. Poder de resolução: capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos distintos. Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos podem estar para o aparelho os mostrar individualizados.

O que determina pois a riqueza dos detalhes da imagem fornecida por um sistema de imagens é o seu poder de resolução e não o seu poder de ampliar o tamanho dos objetos. A capacidade de aumentar só tem valor prático se for acompanhado de um aumento do poder de resolução. Este limite de resolução depende essencialmente da objetiva, já que as oculares não

Professores: Dr. NewtonSoares da Silva e Dra. Cristina Pacheco-Soares 5 podem acrescentar detalhes à imagem, pois a sua função é aumentar de tamanho essa imagem, que é projetada no seu plano de focagem pela objetiva.

INSTRUMENTOS USADOS EM CITOLOGIA Microscopia:

Óptica: Campo luminoso

Campo escuro Ultravioleta Fluorescente Contraste de fase

Eletrônica: Transmissão Varredura

Citoquímicas Permitem estudar a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células, através de técnicas in situ, nas quais as células são preservadas intactas e as substâncias detectadas por técnicas que dão reações coradas ou cujo produto é eletrondenso, ou extra situ, que se baseiam no fracionamento celular e no estudo dos componentes isolados.

No primeiro caso procede-se à execução de preparações definitivas com colorações específicas, no segundo caso recorre-se a outras técnicas laboratoriais, tais como, centrifugação, filtração, com posterior utilização dos produtos obtidos para identificação e quantificação por técnicas de cromatografia, espectrofotometria entre outras.

Imunocitoquímicas

As técnicas de imunocitoquímica permitem o estudo da localização intracelular de proteínas específicas, sendo estas técnicas muito superiores ás técnicas de identificação de proteínas baseadas na verificação de aminoácidos. Estas técnicas baseiam-se na reação antigeno-anticorpo.

Radiofotografia

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A radiofotografia é aplicada como uma técnica citoquímica in situ para a detecção de isótopos radioativos e baseia-se na sensibilidade das emulsões fotográficas ás radiações ionizantes. Como não existem nas células elementos radioativos, podemos seguir pela radiofotografia a incorporação e a movimentação de compostos radioativos, introduzidos nas células com finalidades experimentais.

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MICROSCOPIA A microscopia tem a maior importância no estudo das células. Muitas características importantes de interesse nos sistemas biológicos são demasiado pequenas para serem vistas a olho nu, só podendo portanto, ser observadas com o microscópio. Nos anos mais recentes, tem-se notado um grande desenvolvimento em microscópios, corantes, protocolos de coloração e técnicas de preparação para ajudar a esclarecer melhor a estrutura e função das células. Descreveremos as capacidades e aplicações das várias técnicas de microscopia usadas para visualizar as células, as suas estruturas subcelulares e ainda as suas moléculas.

As estruturas celulares que necessitamos de estudar têm dimensões que, em regra, são invisíveis à vista desarmada. 1mm (milímetro) = 1 0 µm (micrômetro) = 1 0 0 nm (nanômetro) = 10 0 0 Å (Angstrom). O olho humano só consegue formar imagens de objetos com dimensões superiores a cerca de 0,2mm. Para observar objetos menores é necessário formar deles uma imagem ampliada.

Os microscópios são os aparelhos utilizados para formar essas imagens. Radiação eletromagnética Os microscópios usam radiações eletromagnéticas para formar imagens ampliadas dos objetos a observar. O microscópio óptico usa a luz visível (radiação eletromagnética com comprimento de onda compreendido entre 400 e 800 nm). O microscópio eletrônico usa raios catódicos (feixe de elétrons) cujo comprimento de onda é inversamente proporcional à voltagem de aceleração dos elétrons usados no microscópio, sendo de 0,0037nm para uma voltagem de 100KV.

Resolução e ampliação Há um limite mínimo para a dimensão dos objetos que podem ser observados com um determinado sistema óptico, limite esse que se denomina resolução do sistema.

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Por exemplo, a resolução do olho humano é de cerca de 0,2mm, e é determinada pela estrutura celular da retina. A de um microscópio óptico é de 0,2mm e é limitada pelo comprimento de onda da luz visível.

A ampliação da imagem produzida pelo sistema óptico permite observar objetos de dimensões inferiores a 0,2 m (resolução do olho humano), mas apenas até ao limite de resolução do sistema óptico. Objetos menores que este limite não podem formar imagens, por maior que seja a ampliação utilizada. A ampliação útil é a ampliação necessária para que a imagem do objeto se torne visível, ou seja, para que atinja dimensões iguais ou superiores ao limite de resolução do olho humano. Para conforto do observador, as imagens são ampliadas até dimensões que tornam a sua observação confortável. O fator de ampliação adicional é a ampliação vazia. Exemplo: Para que um objeto no limite de resolução do microscópio óptico se torne visível é necessário ampliá-lo: 0,2mm / 0,2 µm = 200 µm / 0,2 µm = 1000 x. Para uma observação confortável, podemos ampliá-lo até 1mm, utilizando um fator de ampliação adicional de 1mm/0,2mm=5. Vê-se assim que a ampliação útil de um microscópio óptico não excede as 1000x

Tipos de microscópio O limite de resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da radiação eletromagnética usada para formar a imagem e de aberrações das lentes. Deste modo, pode-se melhorar a resolução construindo microscópios que utilizem radiações de comprimento de onda menor que o da luz visível. A construção deste tipo de microscópios depende da capacidade de produzir lentes para a radiação em causa. A radiação ultravioleta permite algum ganho de resolução, mas é usada principalmente nos microscópios de fluorescência. Os raios-X começam a poder ser usados com lentes especiais, e raios-gama não foram ainda usados por falta de dispositivos que possam funcionar como lentes. Os

Professores: Dr. NewtonSoares da Silva e Dra. Cristina Pacheco-Soares 9 raios catódicos (feixes de elétrons) utilizam ++ e são usados nos microscópios eletrônicos.

Nos microscópios mais comuns, o feixe de radiação é estático e irradia simultaneamente toda a área observável da amostra. Noutros aparelhos

(microscópios de varredura), o feixe possui dimensões muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra, e é dotado de um movimento relativamente àquela, irradiando em seqüência todos os pontos do objeto

(varredura). O microscópio óptico usa a luz visível como radiação eletromagnética. Os componentes principais do microscópio óptico são: • Fonte luminosa:

• Condensador

• Diafragmas de campo e do condensador

• Platina

• Objetiva

• Tubo

• Oculares MICROSCÓPIO ÓPTICO FOTÓNICO COMUM No microscópio óptico de transmissão a luz emitida pela fonte luminosa e concentrada pelas lentes condensadoras, atravessa a amostra e penetra na objetiva. A objetiva forma uma imagem real, ampliada, do objeto e as oculares formam uma imagem virtual, também ampliada, da imagem real produzida pela objetiva. A imagem virtual situa-se à distância de 25cm do olho do observador, e é a imagem que pode ser observada. A ampliação total é o produto dos fatores de ampliação da objetiva e das oculares, podendo existir outros dispositivos no trajeto da luz que introduzam fatores multiplicativos adicionais. O feixe luminoso que atravessa a amostra é modificado por interações com esta, que consistem na absorção de certos comprimentos de onda produzindo cor, difração, refração, reflexão, diferença de fase etc. Estas interações vão-se

Professores: Dr. NewtonSoares da Silva e Dra. Cristina Pacheco-Soares 10 traduzir na produção de diferenças de cor ou de intensidade luminosa na imagem do objeto, que podem ser percebidas pelo olho humano.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Ambos os microscópios usam a propriedade de dar contraste a estruturas biológicas transparentes à luz visível, visto que fazem mudanças de fase e/ou atrasos nas radiações que atravessam essas estruturas. O microscópio de contraste de fase usa um condensador e objetivas especiais. O condensador está provido de um diafragma em forma de anel (diafragma anular) que produz um cone oco da luz que o atravessa. A luz ilumina o objeto e o que o rodeia. A luz que passa o objeto é desviada em relação à que passa diretamente o meio que o rodeia. O efeito de fase depende da interferência entre a imagem geométrica direta e a imagem difratada lateral. Se os dois grupos de raios se somam em contraste brilhante ou negativo o objeto aparecerá mais brilhante que o meio. Quando o contraste é positivo ou escuro os jogos de raios experimentam uma interferência subtrativa sendo a imagem do objeto mais escura que o meio. Deste modo, pequenas mudanças de fase são transformadas em diferenças de amplitude (intensidade).

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Para obter os dois tipos de contrastes o microscópio é provido de objetivas com dispositivos de fase específicos:

Conforme os fabricantes de microscópios o contraste escuro pode ser obtido com dois dispositivos diferentes (ver Figuras A e B). Utilizando o dispositivo A, a luz direta é

Professores: Dr. NewtonSoares da Silva e Dra. Cristina Pacheco-Soares 12 levada ao foco da objetiva onde está colocada à placa de fase. Esta, tem uma ranhura em forma de anel que é coberta por uma fina camada de metal que tem por fim fazer avançar os sados comparativamente à luz da da do objecto. Os esquemas mostram a passagem da luz através da preparação, e os dispositivos de fase. Os esquemas mostram a passagem da luz através da preparação, e os dispositivos de fase.

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