Cultivo de larvas en ratones para la obtención de antígeno

Cultivo de larvas en ratones para la obtención de antígeno

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Cultivo de larvas en ratones para la obtención de antígeno

Cultivo de larvas de Taenia crassiceps en ratones BALB/c para la obtención de antígeno para inmunodiagnóstico SP Agudelo L1, LE. Botero P1,2, JG Restrepo S1 y JF Florez2,3

Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales - GIEPI1 Corporación de Ciencias Básicas Biomédicas2 Departamento de Educación Médica Grupo Informática Médica3 Universidad de Antioquia

Correspondencia: SP Agudelo L. GIEPI, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Carrera 51 D No. 62 – 29. Tel.: 57 4 219 60 5 e-mail: pilaragudelo@yahoo.com

ResumenLos antígenos de cisticercos de Taenia solium (T. so) tienen una impresionante homología con los antígenos de Taenia crassiceps (T.cra), ventaja que posibilita el uso de estos como un substituto de los cisticercos de T.so, ya que son reconocidos de forma cruzada por los anticuerpos de los pacientes con cisticercosis Adicionalmente se presentan escasas infecciones en humanos por T.cra, y la obtención de grandes cantidades de cisticercos de T.cra resulta económica y simple a través de un modelo experimental de infección en ratones.

En este reporte, 97 ratones hembras BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad con un promedio de peso corporal de 21 g fueron inoculadas dentro de la cavidad peritoneal con 8 a 10 cisticercos T.cra de la cepa ORF. Posterior a la infección, se mantuvieron en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, asegurando la disponibilidad de agua y alimento con periodos de luz y obscuridad de 12 horas cada uno. Los animales se pesaron dos veces por semana y se evaluaron las condiciones físicas y comportamentales durante la infección.

Después de la inoculación de los cisticercos el tiempo promedio para alcanzar el desarrollo de la infección fue de 40 días. Durante este tiempo el peso corporal tuvo una ganancia que representa un incremento del 4% comparado con el peso inicial del ratón. La tasa de infección estuvo entre el 6% y el 100%. Al finalizar la infección y aplicar la eutanasia fue posible recuperar un promedio de 482 cisticercos por animal. Durante el tiempo que demoró el desarrollo de la infección las condiciones fisiológicas de los animales no se vieron alteradas, logrando establecer, de esta forma, en nuestro laboratorio el cultivo de cisticercos de T cra y una fuente alternativa de antígeno para el inmunodiagnóstico de la cisticercosis tanto humana como porcina.

Palabras Claves: Taenia crassiceps, Cisticercos, Taenia solium, BALB/c, cisticercosis.

INTRODUCCIÓNLa alta prevalencia de la cisticercosis humana y porcina como una enfermedad grave y frecuente en países en desarrollo tiene elevados requerimientos de antígenos de Taenia solium (T. so) tanto para el diagnóstico de la enfermedad como para la investigación. La preparación de extractos antigénicos adecuados en cantidades suficientes para el diagnóstico de la cisticercosis está aun ligado a la obtención de cerdos naturalmente infectados con cisticercos de T.so, los cuales usualmente se encuentran en condiciones clandestinas haciendo difícil de localizarlos, interfiriendo en la producción de antígeno a gran escala y requiriendo de procedimientos especiales para la purificación específica de antígeno. De otro lado, antígenos sintéticos de T.so no están disponibles en países en desarrollo por sus altos costos, no financiados por entes gubernamentales (1, 2)

hecesVarias cepas de T. cra han sido aisladas y mantenidas bajo condiciones de laboratorio (3-5), y la cepa ORF ha

Taenia crassiceps (T.cra) (Zeder, 1800; Rudolphi, 1810) es un céstodo cuya forma adulta se encuentra en el intestino de zorros rojos (Vulpes vulpes) de Europa y de Norte América. El estado larvario, cisticercus longicollis (Rudolphi, 1819), se desarrolla en pequeños roedores, los cuales adquieren la infección por la ingestión de los huevos que se encuentran en las heces de los zorros rojos. En los roedores, los cisticercos pueden multiplicarse asexualmente produciendo gemas en su polo abscolex (3). Posteriormente, el zorro rojo caza y come un roedor pequeño con lo que adquiere los cisticercos y desarrolla la forma adulta de la Taenia en su intestino y comienza a expulsar los huevos en las sido una de las mas ampliamente utilizadas debido a su capacidad para multiplicarse rápidamente en la cavidad peritoneal del ratón (3, 6).

La reactividad antigénica cruzada entre cisticercos de T. so y T. cra (7) ha permitido el uso de antígenos de T. cra para la detección de anticuerpos en muestras de líquido cefalorraquídeo y suero provenientes de humanos y de muestras de suero de cerdos con cisticercosis por T. so (1, 2, 8-18).

Las principales ventajas del cultivo in vivo de cisticercos de Taenia crassiceps en ratones BALB/C como una fuente de antígenos para el inmunodiagnóstico de la cisticercosis son:

- El modelo experimental murino se convierte en una fuente de cisticercos de T. cra, evitando el requerimiento de

Bioterios.com: Aprendiendo de los animales de laboratorio http://www.bioterios.comPotenciado por Joomla!Generado: 19 March, 2011, 08:38 cerdos infectados con T.so. - El costo de la producción del antígeno es mínimo puesto que los cisticercos de T. cra pueden crecer y permanecer por largo tiempo en ratones de laboratorio (16). - La posibilidad de mantener y controlar condiciones estándar para la obtención y procesamiento de los antígenos, asegura la estabilidad y reproducibilidad de las pruebas donde aquellos antígenos podrían ser utilizados (19). Nuestro objetivo es establecer las condiciones óptimas y mantener un modelo animal para obtener cisticercos de T.cra como fuente de antígeno sustituto de T.so para el inmunodiagnóstico de la cisticercosis en pacientes humanos y en cerdos infectados de nuestro país (Colombia). METODOLOGÍA

Ratones: Todos los ratones fueron obtenidos del bioterio de la Sede de Investigaciones Universitaria de la Universidad de Antioquia (Medellín, Colombia). Para cada repique, se utilizaron grupos de 12 ratones hembras BALB/c, entre 6 a 8 semanas de edad. El promedio del peso corporal de los animales fue de 21.29 g. Todos los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo las recomendaciones del Comité de ética para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Antioquia y acorde con las Leyes Colombianas en Experimentación Animal.

Mantenimiento: Grupos de 4 ratones marcados individualmente se mantuvieron en cajas plásticas de 30*25*15 cmLos

ratones fueron marcados tiñendo sus orejas con acido pícrico y asignando un código de acuerdo al número de la caja y número de experimento. Las camas fueron hechas de viruta previamente esterilizado. La temperatura promedio a la cual se mantuvieron los animales fue de 24°C, con una humedad relativa del 71% y con ciclos naturales de luz de aproximadamente 12 horas. La alimentación (Rodentina ®) y agua fueron ofrecidos at libitum.

Parásitos e infección: La infección experimental en los ratones se logró mediante la inoculación de 8 a 10 cisticercos pequeños no gemantes de la cepa ORF de T. cra en la cavidad peritoneal del ratón utilizando una jeringa tuberculina (Rymco®) con una aguja 18G x 1” – 25 x 1,2 m (Nymco®). Los cisticercos del inóculo estaban resuspendidos en 0.3 ml – 0.4mL de solución fosfato salino tamponado al 1% (PBS) (BioWhittaker®), pH de 7.2 y con adición de antibióticos (gentamicina 40μg/mL, Sigma G 1272). La cepa ORF de T.cra fue gentilmente donada por Dr Adelaide J. Vaz, laboratorio de Inmunología Clínica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil.

Valoración de los ratones: Los ratones fueron monitoreados diariamente en cuanto a su condición de salud general y de comportamiento. Dos veces por semana se determinó el peso corporal usando una balanza Ohaus Navigator (Mod. 4210), su temperatura utilizando una termometro rectal H-25KF Thermometer ΩE® (Omega Engineering, Inc.) y las condiciones físicas generales.

Determinación del Punto Final: Cuando los ratones hembras adquirían la apariencia física del final de la gestación, se determinaba el punto final, es decir, se seleccionaban para someterlas a vapores anestésicos, eutanasia por dislocación cervical y posteriormente la extracción de los cisticercos mediante lavado de cavidad peritoneal.

cavidad peritoneal se realizaron en cámara de bioseguridadAsí, una vez cada animal fue sometido a eutanasia, se

Obtención y selección de los cisticercos de T.cra: Para la extracción de los cisticercos, los procedimientos de lavado de impregnó todo el pelaje con una solución antiséptica de alcohol al 70%, luego fue fijado a una tabla de disección y se inyectaron 3 mL de PBS estéril dentro de la cavidad peritoneal. A continuación se hizo una incisión de 0.5 cm en la pared abdominal y se extrajeron los cisticercos, succionando varias veces y depositando el material recolectado en tubos Falcon® estériles. Una vez recolectados los cisticercos, se evaluaron macroscópicamente los órganos del ratón para determinar si había alguna clase de daño atribuible al desarrollo de los cisticercos. Estudios histopatológicos no se realizaron en ninguno de los experimentos.

Los cisticercos fueron lavados tres veces con PBS estéril con antibióticos, luego fueron depositados en una caja de Petri para seleccionarlos de acuerdo a su aspecto macroscópico como densos (mayor densidad y opacidad óptica) o como viables (mayor brillantez y transparencia), haciendo un conteo final del total de cisticercos viables y determinando su peso neto (sin PBS). Finalmente, dos lavados adicionales fueron realizados antes de ser inoculados nuevamente o de obtener extracto antigénico.

Análisis Estadístico: La información recolectada fue procesada utilizando Graph Pad Software, Versión 4.0, y Microsoft ® Excel 2003. El análisis estadístico que se realizó fue para un estudio de tipo descriptivo.

Éxito de la Inoculación: La cepa ORF de T cra fue inicialmente inoculada en trece ratones hembras BALB/c. Sólo el 30% de los ratones inoculados fueron exitosamente infectados (Tabla 1). Después de la inoculación inicial, 9 repiques más fueron realizados, incluyendo para esto 97 ratones hembras BALB/c, de los cuales 7 fueron exitosamente infectados. Posteriormente, el éxito en la inoculación fue establecido desde un 6.67% hasta 100% con una producción estable de cisticercos bajo condiciones controladas de crecimiento.

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Ganancia de peso de los ratones infectados: El promedio de la ganancia de peso de cada ratón fue de 9.11g +3.48 (d.s.), lo cual corresponde al 4% del peso inicial corporal. Del total del peso ganado, el 65% pudo justificarse por los cisticercos cultivados en la cavidad abdominal de los ratones (Fig.1).

Mortalidad de la Infección con T.cra: Ocho (8.25%) de los 97 ratones infectados, murieron durante el desarrollo de los experimentos. De los ocho, sólo a 4 se les realizó estudio postmortem en el cual se demostró intususcepción para los animales analizados. Ninguno de ellos reveló infección con los cisticercos al momento de la muerte.

Tiempo requerido para la obtención de cisticercos: El tiempo promedio de la infección fue de 40.71 días después de la inoculación intraperitoneal. Durante este tiempo se obtuvo un número significativo de cisticercos (Fig.1), sin poner en riesgo las condiciones de vida de los ratones. Sin embargo, al día 28 después de la inoculación, los cisticercos ya habían iniciado su proceso de gemación en la cavidad abdominal de los ratones inoculados.

Cantidad de Cisticercos por cosecha: El recuento promedio de los cisticercos obtenidos se encuentra descrito en la Tabla 2. Observe que el número de cisticercos obtenidos oscila entre 85 y 1447 cisticercos por ratón con un promedio total de 482 cisticercos obtenidos de la cavidad abdominal.

Efecto de la infección con los cisticercos en la temperatura corporal de los ratones: Además de nuestro objetivo inicial, nosotros decidimos considerar si la temperatura de los ratones estuvo afectada por la infección por T cra. Para ésto, determinamos la temperatura de cada ratón vía rectal dos veces por semana, al mismo tiempo que el peso corporal fuera determinado. La determinación de la temperatura se realizó en los grupos de los ratones del tercer al octavo repique. La temperatura de los ratones estuvo entre el rango normal (36.5 a 38.0ºC). Sin embargo, algunos de los ratones presentaron temperaturas por debajo (35.6°C) o por encima (38.8°C) del rango normal. La temperatura promedio para todos los grupos fue de 37.49°C. No se encontraron diferencias significativas entre infectados y no infectados (Información no mostrada).

Este es uno de los pocos reportes que describe en detalle el cultivo in vivo de Taenia cassiceps en ratones BALB/c, después del trabajo publicado por Reino S. Freeman en 1962 (3). De ahí que nuestro objetivo fue establecer las condiciones para un modelo animal como fuente de antígeno sustituto de T.so para el diagnóstico de la cisticercosis.

De acuerdo con lo reportado por Freeman (3) los primeros resultados de la infección experimental con T.cra fueron reportados por Braun, M. en 1896 y por Studer, M. y Baer, J.G. en 1949. Freeman encontró que la especie de ratón y el sexo interferían en el desarrollo de la infección con cisticercos de T. cra (3). En su reporte, él hizo ensayos inoculando varias especies de animales encontrando que en hamsters, los cisticercos de T. cra permanecían vivos por más de 65 días sin reproducirse, y en cerdos ellos sobrevivieron entre 14 y 21 días después de la inoculación. En conejos y guinea pigs los cisticercos sufrieron degeneración. En cambio, los cisticercos sobrevivieron y se multiplicaron en los ratones, siendo así usados para experimentos posteriores (3).

Existen reportes que evidencian que la respuesta inmune del hospedero frente al parásito es influenciada por el genotipo del hospedero (20). Así, el desarrollo de T.cra se ve favorecido en ratones de la cepa BALB/c y especialmente en ratones de la subespecie BALB/cAnN, pero por el contrario la cepa de ratones C57BL/6J no permite el desarrollo de los cisticercos (3, 21).

machos hizo que ellos perdieran su típica capacidad reproductiva masculinaLos efectos en el sistema reproductivo

El sexo del hospedero también es un factor importante, puesto que el primer reporte mostró que las hembras más tolerantes a la infección que los machos y esta mayor susceptibilidad parece estar asociada con altos niveles de estrógenos circulantes (6, 2, 23). Un interesante hallazgo fue que la infección crónica con cisticercos de T.cra en ratones masculino incluyeron una marcada dilatación y una fibrosis circundante de los testículos y vesículas seminales. En los testículos se observó adicionalmente disminución en los espermatozoides. Los machos sufrieron un proceso de feminización que se caracterizó por la elevación de los niveles séricos de 17 - b estradiol en más de 200 veces por encima de los valores normales en el suero y además por la disminución de los niveles de la testosterona alrededor del 90% por debajo de lo normal (24). Otro aspecto importante fue determinar la vía de inoculación mas apropiada. De la misma manera, Freeman llevó a cabo estudios en los cuales determinó que después de la inoculación, la recuperación de cisticercos vivos tuvo un mayor rendimiento, es decir, se recuperó un número mayor de cisticercos utilizando la inoculación intraperitoneal (75%) comparado con otras rutas como la subcutánea (5%) o la intrapleural (15%) (3).

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