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AFilariose linfática causada pela Wuchereria bancroftié uma doença negligenciada, de caráter debilitante, que acomete cerca de 120 milhões de pessoas em todo mundo (FONTESet al., 2005). Essa enfermidade vem ocupando, há onze anos, o 2lugar no rankingmundial das doenças incapacitantes (WHO, 1995). No Brasil, estima-se em três milhões a população que vive em áreas com risco de contrair a parasitose e em 49 milhões o número de infectados. Esses indivíduos residem, em sua maioria, em áreas urbanas dos estados de Alagoas (Maceió) e Pernambuco (Região Metropolitana do Recife – RMR). (MEDEIROS et al., 2004). O grave impacto sócio-econômico provocado pela bancroftose, em sua fase avançada, tem sido estudado por diversos pesquisadores, nas mais variadas localidades do mundo, onde a doença é endêmica (BABU & NAYAK, 2003). Em trabalhos realizados na Índia, por Ramaiah et al., (2000) avaliou-se que a média dos custos anuais com o tratamento de casos crônicos foi calculada em cerca de R$ 52 milhões. Dreyer et al., (2005) relataram, ainda, que o forte estigma atribuído a essas pessoas, juntamente com a inaptidão física, faz com que estes se tornem excluídos das oportunidades de emprego. Toda a problemática acima exposta encontra-se intimamente relacionada com a patogenia e manifestações clínicas que acompanham essa subestimada doença. Como em sua fase avançada a bancroftose não possui tratamento eficaz na redução de seus sinais, é importante que os infectados sejam diagnosticados o mais precocemente possível. Diante disto, o presente trabalho visa fornecer informações relevantes acerca das técnicas disponíveis para o diagnóstico da Filariose Linfática, contribuindo assim para otimização dos laboratórios de análises clínicas e conseqüente minimização do impacto da bancroftose.

O diagnóstico clínico da bancroftose é particularmente difícil. Por possuir baixa sensibilidade e especificidade, necessita de uma confirmação laboratorial. No entanto, em área endêmicas, a história clínica de febre recorrente associada com adenolinfangite, é um forte indicativo de infecção (FONTES, 1998). O diagnóstico da filariose linfática causada pela W. bancroftipode ser realizado por diferentes técnicas parasitológicas, imunológicas, moleculares e por imagem.

Há várias décadas, a única prova conclusiva e comprobatória da infecção filarial tem sido o encontro de microfilárias no sangue periférico ou nos líquidos biológicos (urina, líquido hidrocélico, quilocélico ou sinovial) (ROCHA, 2004). A pesquisa parasitológica pode ser realizada através de técnicas como a gota espessa de sangue, concentração de Knott e filtração de sangue em membrana de policarbonato, nas quais a coleta sangüínea deve ocorrer entre 23 - 01 h (DREYERet al., 1996). Essas duas últimas são técnicas de concentração, que trabalham com um volume maior de sangue, aumentando sua sensibilidade em relação à gota espessa. Porém, em decorrência da dificuldade de execução e também

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Filariose Linfática: Avanços e Perspectivas do

Diagnóstico Laboratorial - Revisão

Lymphatic Filariasis: Progresses and Perspectives of the Laboratorial Diagnostic – A Review

Eduardo Caetano Brandão F. da Silva; Maria Almerice Lopes da Silva& Paula Alexandra dos S. Oliveira

RESUMO- A Filariose Linfática, também conhecida como elefantíase em sua fase crônica, é uma doença endêmica de regiões tropicais e subtropicais que possui como agente etiológico helmintos da espécie Wuchereria bancrofti. Enfermidade debilitante, de grave impacto sócio-econômico, acomete cerca de 120 milhões de pessoas em todo mundo. No Brasil, estima-se em 49 mil o número de indivíduos infectados, sendo estes encontrados principalmente no município de Maceió-AL e Região Metropolitana do Recife-PE. A dificuldade na realização do diagnóstico, a falta de saneamento básico e a alta densidade populacional de vetores fazem desta infecção uma endemia de difícil controle e erradicação, sendo, por esse motivo, alvo de inúmeros programas propostos pela OMS e OPAS. Associadas a esses programas, pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de avaliar as técnicas atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos métodos de diagnóstico mais sensíveis e mais específicos, possibilitando assim uma redução no número de indivíduos com formas mórbidas da doença. O objetivo do presente trabalho é fornecer informações relevantes acerca das técnicas disponíveis para o diagnóstico da Filariose Linfática, contribuindo assim para otimização dos laboratórios de análises clínicas.

PALAVRAS-CHAVE- Filariose Linfática, Wuchereria bancrofti, Diagnóstico.

SUMMARY- Lymphatic Filariasis, also known as elephantiasis in your chronic phase, it is an endemic disease of tropical and subtropical areas that has the Wuchereria bancrofti helminthes which agent etiologic. Illness weakling of serious socioeconomic impact attacks about 120 million people in all the word. In Brazil, is possible that 49 thousand of individuals are infected, whose the majority live in the municipal district of Maceió and Recife Metropolitan Area. The difficulty in the development of the diagnosis, the lack of basic sanitation and the great population density of vectors they do of this infection an endemic disease of difficult control and eradication. Therefore this illness is target diverse WHO and OPAS programs. Together with the those programs, researches have been accomplished with the purpose of evaluating the techniques available in the moment, as well as to develop more sensitive and specific diagnosis methods, making possible a reduction in the number of individuals with morbid forms of the disease. The purpose of the present article is to supply important information about the available techniques for the diagnosis of Lymphatic Filariasis, contributing to optimization of the analyses clinical laboratories.

KEYWORDS- Lymphatic Filariasis, Wuchereria bancrofti, Diagnostic.

Recebido em 19/07/2007 Aprovado em 16/05/2008Departamento de Parasitologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – Fundação Oswaldo Cruz de visualização das microfilárias, as técnicas quantitativas de Knott e filtração em membrana de policarbonato não são utilizadas na rotina e em inquéritos epidemiológicos. No entanto, são bastante utilizadas no diagnóstico de casos individuais e no controle pós-tratamento (HINRICHSEN et al., 2005).

Gota espessa De acordo com OMS, o diagnóstico parasitológico se baseia na pesquisa de microfilárias no sangue periférico, colhido em horário compatível com a periodicidade do parasito na região. Entre as técnicas disponíveis, a mais utilizada em inquéritos epidemiológicos é a gota espessa de sangue (20 a 100 μL), colhido por punção capilar digital. Em seguida, a amostra é fixada, corada (eosina-Giemsa) e analisada em microscopia óptica. Essa técnica é particularmente importante para o diagnóstico específico em áreas onde ocorrem infecções mistas, pois a gota espessa possibilita a visualização da bainha, fato que difere a microfilária de W. bancroftide outro filarídeos sanguíneos (SILVA et al., 2004). A técnica da gota espessa apresenta um baixo custo em comparação com outras mais avançadas, como a filtração de sangue em membrana de policarbonato, o ensaio imunoenzimático e o ICT card. No entanto, sua baixa sensibilidade impede a utilização em situações em que os parasitados se mostram com baixa microfilaremia ou amicrofilarêmicos (SILVA et al., 2004).

Concentração de Knott A técnica descrita por Knott em 1939 foi o primeiro método a utilizar a concentração de sangue no diagnóstico filarial. Apesar de ser uma técnica descrita há mais de 60 anos, Melrose, em 2002, constatou que nos dias atuais, este método ainda permanece em uso em diversas áreas endêmica do mundo. A técnica permite a utilização de 1 ml de sangue venoso diluído em 9 ml de formalina a 2 %. O sistema é submetido à agitação vigorosa, centrifugado a 2000 rpm/10 min, tendo o sobrenadante removido e o sedimento lavado com formalina a 2%. Repete-se o procedimento até limpidez do sobrenadante, sendo este descartado e o sedimento distribuído em lâminas. O material é fixado, corado e analisado sob microscopia óptica.

Filtração em membrana de policarbonato Descrita por Bell, a técnica de filtração de sangue em membrana de policarbonato foi introduzida em 1967. De custo elevado em relação aos métodos parasitológicos anteriormente descritos, baseia-se na passagem de sangue venoso através de uma membrana (Milipore ou Nuclepore) de diâmetro de 13 a 25 m e poros de 5 ou 3 μm. Essa técnica, assim como a de Knott, permite a identificação de indivíduos com baixíssimas parasitemias (quantidade de microfilárias não-detectáveis pela técnica de gota espessa) (ROCHA, 2004).

O diagnóstico parasitológico da doença é particularmente difícil em pacientes que apresentam sintomas inflamatórios e se encontram na fase crônica, ou que apresentam quadro pulmonar (eosinofilia pulmonar tropical), situações nas quais as microfilárias estão normalmente ausentes do sangue periférico (SILVA et al., 2004). Por essa razão avaliações imunológicas e de biologia molecular têm sido desenvolvidas e aperfeiçoadas.

Pesquisa de antígeno Técnicas mais avançadas, que se baseiam na pesquisa de antígenos filarial circulantes, através de anticorpos monoclo- nais, como o ensaio imunoenzimático (Og4C3-ELISA) e o teste de imunocromatografia rápida (ICT card test-AD12), mostraram sensibilidade e especificidade superior aos métodos parasitológicos (ROCHA, 2004). Trabalhos desenvolvidos em Maceió por Silvaet al.(2004) relataram uma sensibilidade 4,5 vezes maior do ICT card test, quando em comparação com o método parasitológico da gota espessa de sangue (IC 95% 1,3 – 16,9). Em outro estudo, realizado na Região Metropolitana do Recife, por Rocha et al.(1996), avaliando a sensibilidade do Og4C3 frente a grupo de indivíduos amicrofilarêmicos e microfilarêmicos, portadores de vermes adultos detectados pela ultra-sonografia, verificaram que a sensibilidade variou 70 a 100%, respectivamente. Um fator limitante na utilização desses testes é o custo elevado para obtenção dos Kits, o que restringe sua aplicação em serviços de saúde, onde a demanda é elevada. No entanto, por serem os mais promissores, servem de incentivo para que novos trabalhos sejam desenvolvidos no sentido de se pesquisar novos anticorpos. O teste de Og4C3 foi o primeiro a tornar-se disponível comercialmente sob a forma de kit utilizando a técnica do ensaio imunoenzimático (Trop-Ag W. bancroftiELISA kit, manufactured by JCU Tropical Biotechnology Pty. LTDA, Townsville, Queensland, Austrália) (TropBio 1996). Segundo More & Copeman (1990), o Og4C3 é um anticorpo IgM, produzido contra antígenos de O. gibsoni, um parasito bovino. Este anticorpo é também capaz de reconhecer antígenos circulantes que porventura se encontrem no soro ou plasma de indivíduos infectados pela W. bancrofti(ROCHA, 2004). A sensibilidade desse teste, de acordo com os achados de Lammie et al.(1994) é de 100 % quando se tem a filtração de sangue em membrana de policarbonato como padrão ouro. Porém, uma redução na sensibilidade foi evidenciada por Rocha et al., em 1996, quando estudavam indivíduos que possuíam menos de 1 microfilária/ml de sangue ou eram amicrofilarêmicos. Apesar do avanço que foi a descoberta do Og4C3 para o diagnóstico da filariose linfática, a dificuldade de realização da técnica, bem como o custo, mostravam a necessidade de criação de métodos alternativos, mais práticos e de menor custo. Diante disso, o AD12, outro AcMo, foi sintetizado e disponibilizado sobre a forma de uma imunocromatografia rápida, permitindo o diagnóstico rápido da infecção. Viabilizado sob forma de cartão, o diagnóstico que utiliza o AD12, imunoglobulina pertencente à classe das IgG, como captador de antígenos filariais circulantes, foi desenvolvido pela ICT Diagnostic (Balgowlah, New South Wales, Austrália). Atualmente, conhecido como BINAX (ICT “card test”), esse teste, segundo Weil et al. (1997), é capaz de reconhecer antígenos filariais de 200 KD. É um teste de imunodiagnósticoin vitropara detecção de antígenos de W. bancrofti em sangue total, plasma, soro e líquido célico. Baseia-se em uma interação que ocorre entre anticorpos monoclonal e policlonal, na presença de antígeno filarial circulante, que é revelada através de reação colorimétrica (WEILet al., 1997). O AD12 parece ter como propriedade a capacidade de reconhecer a presença de antígenos do parasito adulto, independente da presença ou ausência de microfilárias (ROCHA, 2004). Ambos os testes, Og4C3 e AD12, podem ser realizados nos períodos diurno e noturno, fato que demonstra um grande avanço no diagnóstico da bancroftose. No entanto, o não conhecimento da cinética da antigenemia, após um tratamento antifilarial bem-sucedido, é um fator que necessita ser elucidado para que se possa melhorar o desempenho dos testes. Por esse motivo não devem ser utilizados como critério de cura (DREYER et al., 2005).

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Pesquisa de anticorpo O uso de anticorpos como marcador de doença/infecção não devem ser feito na rotina/pesquisa, devido às evidências de que, mesmo se utilizando a pesquisa de isótopo IgG4, não é possível distinguir o quadro de eosinofilia pulmonar tropical de outras síndromes (EPT-like) produzidas por outros helmintos intestinais (HINRICHSEN et al., 2005). Vários testes para detectar a resposta imune do tipo humoral utilizando a intradermoreação, disponível há mais de sessenta anos (FAIRLEY, 1937), bem como os testes sorológicos que vêm sendo utilizados ao longo dos últimos vinte anos, têm produzido interpretações conflitantes no diagnóstico laboratorial da bancroftose (AMBROISE-THOMAS, 1974, VOLLER & SAVIGNY, 1981, DREYER et al., 1991, ROCHA, 1995). Possivelmente, isto é devido à baixa especificidade que estes testes apresentam (ROCHA, 2000) ou, ainda, em decorrência da utilização de extratos brutos dos parasitos homólogos (por exemplo, a imunofluorescência [IMF] para W. bancrofti) ou heterólogos (imunoenzimáticos [ELISA] com vermes adultos de B. malayi). Isso provoca geralmente reações cruzadas com outras infecções, fazendo com que a especificidade do teste seja prejudicada (ROCHA, 1995). Algumas reações cruzadas são observadas também nas pesquisas que envolvem anticorpos policlonais contra W. bancrofti, a utilização de antígenos purificados certamente elevaria o grau de segurança dos testes que buscam identificar anticorpos específicos. (RAMZY et al.,1995). Outro teste sorológico para filariose linfática, baseado na pesquisa de anticorpos pelo antígeno recombinante filarial Bm14, foi desenvolvido podendo ser realizado a qualquer hora do dia (CHANDRASHEKAR et al., 1994). Este antígeno foi selecionado de uma biblioteca de expressão de cDNA de B. Malayi, denominado gene sxp-1, sendo reconhecido no soro de pacientes com filariose linfática mas não em pacientes com infecção por helmintos não filariais. Estudos preliminares com soro de pacientes da Índia indicaram que o ELISA baseado na detecção de anticorpos IgG4 para Bm14 parece apresentar uma alta sensibilidade para o diagnóstico de pacientes com filariose por brugia ou bancroftiana com infecção ativa ou em endêmicos normais (CHANDRASHEKARet al., 1994). Dissanayakeet al., (1994) sugerem que um antígeno recombinante originário de uma biblioteca de cDNA de MF deB. malayiparece só estar presente nos indivíduos verdadeiramente infectados com W. bancrofti ouB. malayi. Esse teste é capaz de distinguir indivíduos com infecção ativa daqueles com infecção passada ou indivíduos que foram simplesmente expostos às larvas infectantes, sem se tornarem infectados. Verificaram também que não existe correlação entre a carga parasitária e a positividade do teste, demonstrando que a resposta de anticorpos ao produto do gene sxp-1 não é estágio específico e a sua positividade indica a presença de vermes adultos jovens ou maduros com ou sem microfilaremia.

Nos últimos anos, a biologia molecular, também, obteve avanços e trouxe uma contribuição impar, não apenas para o diagnóstico da filariose bancroftiana, como também de outras patologias. A utilização das ferramentas de biologia molecular nos estudos da filariose teve início a partir do ano de 1980, quando muitos pesquisadores deram ênfase e desenvolveu-se o procedimento de isolar e caracterizar seqüências de DNA filarial espécie-especificas. Um dos principais objetivos foi introduzir uma nova metodologia que pudesse substituir a dissecção manual de milhares de mosquitos na avaliação do impacto dos programas de controle nas áreas endêmicas através da monitorização da infecção vetorial (ROCHA, 2004). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma metodologia que vem sendo padronizada e que tem se mostrado promissora, principalmente no tocante a análise dos exemplares de mosquitos (ROCHA, 2002). Como forma de diagnóstico, a PCR foi inicialmente utilizada para a análise de amostras de sangue coletadas em período noturno, mostrando-se satisfatória. No entanto, sua utilização em pacientes amicrofilarêmicos foi questionada, levando a necessidade de novos estudos. Em 2000, Dissanayake et al., desenvolvendo estudos comparativos entre os métodos parasitológicos, Og4C3-ELISA, ultra-sonografia e PCR, constatou que a PCR não é capaz de detectar DNA em indivíduos amicrofilarêmicos, antígeno-positivo e nem em amicrofilarêmicos portadores de vermes adultos (DREYER et al., 2005). Na atualidade, além da necessidade de padronização adequada, perante as diversas formas clínicas, da disponibilidade dos primersdas famílias repetitivas para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito, o custo elevado é um dos fatores que distanciam a PCR de sua utilização na rotina laboratorial diagnóstica. O desenvolvimento de análises enfocando o genoma filarial tem proporcionado um grande avanço no estudo do diagnóstico molecular da bancroftose como genes candidatos à produção de vacinas (RAGHAVAN et al., 1991). Em 2002, uma revisão realizada por Rocha et al.chamam atenção para as vantagens da utilização da ferramenta molecular no diagnóstico da bancroftose frente aos mais diversos fluidos biológicos. O desenvolvimento da pesquisa de DNA no diagnóstico molecular da filariose linfática, em amostras biológicas, tem aberto novas perspectivas no diagnóstico laboratorial. O diagnóstico da bancroftose, baseado em técnicas de biologia molecular, não está sendo ainda utilizado em larga escala, por não ter sido validado. Alguns pesquisadores estão desenvolvendo e criando alternativas para o diagnóstico molecular da W. bancrofti com a modificação e aperfeiçoamento da técnica de PCR. Assim, Thanomsubet al.(2000) utilizaram a técnica de PCR-RFLP aplicada ao diagnóstico diferenciando espécies de filariais nos seres humano sendo um ensaio simples e de resultado preciso. Chansiri & Phantana (2002) realizaram um estudo onde a técnica de PCR foi muito sensível na habilidade de detectar a presença de 10 pg de DNA do parasito. A PCR pode detectar as larvas infectantes (L3) no mosquitoCulex quinquefasciatus. Hassan et al.(2005) compararam a sensibilidade da técnica de PCR-ELISA em sangue noturno, onde obteve 100%, com as técnicas de filtração em membrana e de pesquisa de antígenos circulantes, identificando a capacidade da técnica em detectar as infecções filariais. Mishraet al.(2005) desenvolveram um método de PCR em uma única etapa onde foram realizadas a detecção combinada dos parasitos filariais humanos, Brugia malayi eWuchereria bancroftimesmo em níveis baixos da infecção. Rao et al., (2006) desenvolveram e avaliou ensaios com PCR em tempo real para detectar a Wuchereria bancroftie também comparou a PCR em tempo real com a PCR convencional (C-PCR) para detectar o DNA de W. bancroftiem amostras de mosquitos coletadas em áreas endêmicas no Egito e em Papua Nova Guiné. Embora os dois métodos tivessem a sensibilidade comparável para detectar o DNA filarial em amostras de referência, a PCR em tempo real foi mais sensível do que C-PCR na prática com amostras do campo. Ou-

179RBAC, vol. 40(3): 177-181, 2008 tras vantagens de PCR em tempo real incluem sua capacidade de elevada especificidade e risco diminuído da reação cruzada entre amostras do teste do DNA de W. bancroftino sangue humano e nos mosquitos.

A ultra-sonografia foi primeiramente descrita, para pesquisa de W. bancrofti, em 1994, quando Amaral et al.em estudos desenvolvidos no Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães evidenciaram vermes adultos em vasos linfáticos intraescrotais do cordão espermático. Este método permite detectar e monitorar vermes adultos vivos e dilatação linfática em pacientes com filariose bancroftiana. Quando desenvolvida de forma correta, essa técnica possibilita o diagnóstico precoce da infecção e contribui para um controle de cura mais eficiente, podendo medir diretamente a ação da droga sobre o parasito (SILVA et al., 2004).

O diagnóstico laboratorial da filariose bancroftiana apresentou um significativo avanço ao longo de pouco mais de um século. Enfermidade que possuiu por muito tempo a gota espessa de sangue como exclusiva forma de detecção de parasitados, atualmente conta com inúmeras técnicas parasitológicas, imunológicas, moleculares e também de diagnóstico por imagem. O desenvolvimento destes métodos ampliou a sensibilidade de detecção dos indivíduos infectados pela Wuchereria bancrofti, auxiliando tanto no tratamento de pacientes assintomáticos, como na erradicação da doença. A técnica que se baseia na pesquisa de anticorpos anti-Wuchereria bancrofti(Bm14), bem como a análise molecular através da PCR, são bastante promissoras em inquéritos epidemiológicos, uma vez que padronizadas permitirão avaliar áreas endêmicas onde a população recebeu tratamento em massa e também no controle da infecção de vetores. Concluiu-se, ainda, que embora a técnica quantitativa de filtração em membrana de policarbonato seja preconizada pela OMS como controle de cura, cada método deve ser utilizado em situações especificas e a associação de mais de uma técnica permite um diagnóstico mais preciso, conferindo assim uma maior fidedignidade ao resultado.

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