Resumo de bioquímica, Resumos de Bioquímica

Baixe Resumo de bioquímica e outras Resumos em PDF para Bioquímica, somente na Docsity! BIOQUÍMICA Ser vivo: alto grau de complexidade química e organização microscópica; existência de sistemas que extraem, transformam e utilizam energia do ambiente; capacidade de autor replicação; mecanismos que sentem alterações no ambiente e respondem a estas alterações; cada um dos componentes possui uma função definida além de interagirem entre si de maneira regulada. ORIGEM DA VIDA NA TERRA  Logo após ter sido formada, a Terra era um ambiente extremamente inóspito, com temperaturas elevadas, altos índices de radiação ultravioleta (devido a ausência de O3) e uma atmosfera com gases tóxicos (CH4, CO, NH3, H2S, etc.).  Vida na Terra surgiu há 3,5 bilhões de anos com o aparecimento das primeiras bactérias, provavelmente nos oceanos. Isso ocorreu devido as resfriamento do planeta e ao aparecimento das primeiras moléculas orgânicas de importância bioquímica. TEORIA DA “SOPA” PRIMORDIAL  Presença dos gases: NH3, H2S CO, CO2 CH4, N2, H2 e H2O (ambiente bastante redutor)  Conjunção de fatores como altas temperaturas, grandes quantidades de radiação UV e elevada incidência de descargas elétricas provenientes de relâmpagos.  Experimento Urey-Miller: Reações entre moléculas simples levam à formação de bases nitrogenadas. Os aminoácidos são produzidos muitos mais facilmente que os nucleotídeos. o Formaldeído  Carboidratos o HCN  Adenina o Glicina o Alanina o Ácido Glutâmico o Leucina Obs: Aminoácidos podem ter sidos usados para a síntese de bases nitrogenadas. A polimerização abiótica de carboidratos e nucleotídeos também ocorre, mas menos facilmente. TEORIA DO MUNDO DO RNA  RNAs podem ter atividade catalítica o Em 1860 criou-se uma hipótese de um “mundo de RNA” habitado por formas de vida primitivas dependentes de RNA para exercer todos os papéis principais em um organismo como herança, armazenamento de informação e catálise de reações específicas envolvidas na síntese de biomoléculas e no metabolismo energético. o O surgimento de uma forma de RNA capas de codificar sua própria replicação foi o principal evento na origem da vida. Este sistema deve ter evoluído para a síntese de catalisadores mais eficientes (proteínas). O DNA então teria assumido o papel de material genético principal enquanto o RNA passou a ter um papel intermediário. o Importância da compartimentalização com o uso de membranas: Durantes a evolução, quantidades suficientes de lipídeos devem ter se acumulado formando vesículas que aprisionaram ácidos nucléicos, formando estruturas semelhantes a célula. A vantagem da compartimentalização é que os produtos de reações enzimáticas não se difundem para o ambiente, podendo ser usado pela célula. Isto ocorre também devido ao fato de a maioria das biomoléculas serem carregadas e não se difundirem pela membrana. TEORIA DO IMPACTO: Moléculas orgânicas vieram do espaço, trazidas por uma espécie de meteoro. Há presença de aminoácidos e bases nitrogenadas. TEORIA DAS FENDAS SUBMARINAS: água superaquecida rica em íons de metais de transição e H2S. Locais de grande atividade biológica, independente da luz solar. A redução de CO2 por FeS geraria moléculas orgânicas mais complexas. TEORIA DA ARGILA: Moléculas orgânicas surgiram inicialmente em reações catalisadas por silicatos. A QUÍMICA DOS ORGANISMOS VIVOS  É baseada no carbono  Importância da água em sistemas bioquímicos: o A água representa 70% ou mais do peso da maioria dos organismos. o São essenciais as forças atrativas entre moléculas de água (pontes de hidrogênio) e a tendência da água em se ionizar ( que influenciam a estrutura e as propriedades dos diversos componentes celulares), ainda muito fracamente. Possibilitam a existência dos sistemas tampões. o Diferenças de eletronegatividade entre o H e O conferem um momento dipolo à água. Este momento dipolo e a presença de pares de elétrons não compartilhados no O é responsável pela formação de pontos de hidrogênio entre moléculas de água. Os orbitais da molécula de água, incluindo os orbitais não-ligantes do oxigênio, possuem um arranjo aproximadamente tetraédrico. o Pontes de hidrogênio: biomoléculas polares se dissolvem na água devido ao fato de poderem trocar interações água-água por interações água-soluto, que são energeticamente mais favoráveis; biomoléculas não polares conseguem formar interações água-soluto e por isso, são muito pouco solúveis em água. Pontes de hidrogênio são mais fortes quando orientadas de maneira a permitir interação eletrostática máxima, o que ocorre quando os átimos envolvidos na ponte de H estão em linha reta. o Água como solvente: A polaridade da água faz com que esta dissolva facilmente substâncias polares (hidrofílicas). Substâncias apolares, por outro lado, não são solúveis em água (hidrofóbicas). OBS: Quanto maior a constante dielétrica menor a força que une as duas cargas, ou seja, a constante dielétrica de um solvente é uma medida de sua capacidade de manter cargas opostas separadas. A água é um dos solventes com maior constante dielétrica. OBS2: Partículas carregas são solvatadas pela água. o Gases apolares são insolúveis em água. Isso tem implicações importantes no transporte de O2 dos pulmões para os tecido e de CO2 dos tecidos para os pulmões. O oxigênio é transportado através de proteínas carreadoras (hemoglobina). O transporte de CO2 é feito principalmente sob a forma de HCO3 - , bastante solúvel em água. o Interações hidrofóbicas: Força que mantem as regiões apolares de moléculas diferente juntas. Resultam de uma maior estabilidade termodinâmica através da minimização de interações com a água. Membranas biológicas são estabilizadas por interações hidrofóbicas. Essas interações entre aminoácidos apolares são importante na estabilização de proteínas. o A importância das interações fracas em sistemas biológicos: são importantes na manutenção da estrutura de biomoléculas. Para separar a enzima de seu substrato é necessário romper as interações simultaneamente, o que é muito difícil. SISTEMA TAMPÃO E SISTEMAS BIOLÓGICOS  Importância de medidas e do controle do pH em Bioquímica o Alterações de pH alteram, por exemplo, a estrutura e a atividade de enzimas por alterarem a ionização de grupos carregados em aminoácidos. Alteram também a estrutura do DNA. Medidas de pH do sangue e da urina são usadas em diagnósticos.  Células e organismos mantem um pH próximo de 7,0 o que ajuda a manter as biomoléculas em seu estado iônico normal. Em organismos multicelulares o pH de fluidos também é rigorosamente controlado.  Sistemas tampão são soluções aquosas que resistem a mudanças de pH quando pequenas quantidade de um ácido ou uma base são adicionados.  Tampão biológico – CITOPLASMA: o Íons fosfato são abundantes nas células na forma inorgânica ou como grupo funcional de moléculas orgânicas mais complexas como ATP ou de precursores metabólicos. Proteínas também contribuem para mante o pH celular. o Tampão fosfato: pKa = 6,86 H2PO4 -  H + + HPO4 2- o Proteínas: Aminoácidos histidina: pKa = 6,04 para histidina livre, mas aprox. 7 em peptídeos e proteínas.  Tampão biológico – SANGUE o Tampão bicarbonato: regula o pH sanguíneo ao redor de 7,4. o O CO2 proveniente da respiração celular nos tecidos está em equilíbrio com CO2 dissolvido e forma o tampão bicarbonato CO2 (g)  CO2 (d) CO2 (d) + H2O  H2CO3 H2CO3  H + + HCO3 - o Constitui um sistema aberto, em que o CO2 tampona perdas de ácido carbônico. A presença de CO2 gasoso nos alvéolos a uma pressão parcial de 40 mm de Hg é responsável por manter a concentração de CO2 dissolvido, que restitui o H2CO3. AMINOÁCIDOS E LIGAÇÃO PEPTÍDICA  Proteínas: o São as macromoléculas mais abundantes; caracterizadas por uma grande diversidade de tamanhos, formas e funções. o São os instrumentos pelos quais a informação genética é expressa. o Fórmula geral de um aminoácido:  Estrutura quaternária: montagem de subunidade de diferentes polipeptídios para formar uma estrutura funcional; agregação de cadeias de polipeptídios separadas em uma proteína funcional. É mantida principalmente por ligações iônicas, pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Pontes de dissulfeto também podem estar presentes.  Estruturas super-secundárias: o Motivos proteicos: são estruturas super-secundárias de repetição. Referem-se ao dobramento proteico apenas, não sendo possível prever a função da proteína, pois proteínas com diferentes funções podem ter alguns motivos iguais. - estruturas super-secundárias do tipo meandro β podem formar proteínas com estrutura terciária na forma de barril chamadas barril β. o Domínios proteicos: unidades de uma cadeia polipeptídica que se dobram de maneira independente um do outro. Muitas vezes sua estrutura é mantida mesmo após retirada do outro domínio. - diferentes domínios normalmente têm diferentes funções como ligação de pequenas moléculas ou interação com outras proteínas. Domínios com conformações similares geralmente estão associados à mesma função, como é o caso de domínios de ligação ao DNA, presentes em fatores de transcrição. CLASSIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PROTEÍNAS FIBROSAS  Apresentam repetições de elementos de estruturas secundárias.  Insolúvel em água devido ao alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos  Papel estrutural (suporte, forma e forma)  Ex: colágeno; α-queratina; elastina; fibroína. o α-queratina: - cabelo, penas e unhas; - α-hélice direita - duas α-hélices se enrolam uma sobre a outra formando um “coiled coil” o que aumenta a resistência da estrutura. Esta se organiza posteriormente em protofilamentos, protofibrilas e filamentos intermediários. - os pontos de contato entre as duas α-hélices de um “coiled coil” são formados por aminoácidos hidrofóbicos. α- queratinas são ricas em Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe. - Rigidez é aumentada por pontes de dissulfeto intercadeias. o Colágeno: - rico em Pro e Gly - alta resistência a tensão. - componentes de pele, tecido conectivo, parede de vasos sanguíneos, córnea, tendões, cartilagem e osso. - α-hélice à esquerda forma uma tripla hélice à direita. - unidades repetitivas de Gly-X-Y, sendo X geralmente Pro e Y geralmente 4-Hyp. o Elastina: - fibra elástica com propriedades semelhantes à borracha. - proteína própria de tecidos conectivos. o Firbroína: - proteína da seda, produzida por insetos e aranhas. - folha β, rica em Ala e Gly. - não extensível, devido à estrutura já estendida da conformação β, mas flexível devido às interações fracas que unem as cadeias polipeptídicas. PROTEÍNAS GLOBULARES  Diferentes segmentos da cadeia polipeptídica (ou diferentes cadeias) dobram-se uma sobre a outra.  Solúveis em água  Funções de transporte, regulação, proteínas motoras, imunoglobulinas e catálise enzimática.  Mioglobina: o Função: armazenamento e difusão facilitada de O2 o Especialmente abundante em músculos de mamíferos que mergulham em grandes profundidades. o O alto grau de empacotamento torna interações de Van der Waals mais importantes na estabilização da proteína. o Formada por 8 segmentos de α-hélice separada por voltas β. o Cadeia punica de 153 aminoácidos e um grupo heme  Grupo Heme: Presente em mioglobina, hemoglobina e citocromo; o átomo de ferro se encontra coordenado a 4 átomos de nitrogênio do anel porfirínico. Das duas posições de coordenação livre, uma é ocupada pelo N de uma histidina e outra pelo O2. PROTEÍNAS MEMBRANARES  Têm pelo menos uma porção solúvel em água.  São muito importantes na comunicação entre as células  Constituem canais que permitem a passagem de átomos ou pequenas moléculas para o interior da célula. DESNATURAÇÃO DAS PROTEÍNAS: É a alteração da estrutura da proteína sem ruptura das ligações peptídicas. A maior parte das proteínas pode ser renaturada quando o agente desnaturante é retirado.  Agente desnaturantes: o Físico: Alterações de temperatura; raios-X; Ultrassom. o Químicos: ácidos e bases fortes; detergentes; uréia; mercaptoetanol.  Alterações das propriedades de uma proteínas desnaturada: o Redução da solubilidade (precipitação em solução) o Aumento da digestibilidade por proteases ou agente químicos (ácidos ou bases, por exemplo) o Perda da atividade biológica (enzimas, hormônios, anticorpos, etc.) FOLDING (DOBRAMENTO) DE PROTEÍNAS RECÉM-SINTETIZADAS  Não ocorre por acaso nem por tentativa e erro. Supõe-se que estruturas secundárias locais se formam primeiro guiados pelas preferências devidas à sequência de aminoácidos. Após isto são estabelecidas interações de curta distância para estabelecer estruturas super-secundárias. O processo continua até a formação de domínios completos e do “folding” da proteína inteira.  Folding assistido: chaperonas o Dois tipos de chaperonas: Hsp 70 (análogo de DnaK em bactérias) e chaperoninas. o O dobramento de algumas proteínas necessita de chaperonas. o Chaperonas DnaJ e DnaK: Não promovem ativamente o dobramento, mas previnem a agregação de proteínas às quais estão ligadas.  Folding assistido: chaperoninas o Exercem papel ativo no dobramento de proteínas; FUNÇÕES DAS PROTEÍNAS 1) Função estrutural – participam da estrutura dos tecidos  Muitas proteínas servem como filamentos de suporte para fornecer proteção ou resistência a estruturas biológicas.  A alta força de tensão da pele o do osso é devida à presença do colágeno, uma proteína fibrosa. O couro é quase que colágeno puro. Os ligamentos contêm elastina, uma proteína estrutural capaz de distender-se em duas dimensões. o Colágeno: proteína de alta resistência, encontrada na pele, nas cartilagens, nos ossos e tendões.  Regulação da afinidade da hemoglobina por O2 pelo 2,3-bifosfoglicerato (BPG) A afinidade da hemoblobina pelo O2 é reduzida pela ligação ao 2,3-difosfoglicerato. Sem BPG, a afinidade da hemoglobina pelo O2 seria muito maior e, assim, pouco O2 seria liberado nos capilares. O BPG tem um papel importante na adaptação do organismo humano a grandes altitudes. Isto ocorre pelo aumento da [BPG] no sangue, o que diminui a afinidade da hemoglobina pelo O2 resultando num aumento na quantidade de O2 liberada nos capilares, o que compensa a falta de oxigênio em grandes altitudes.  Anemia Falciforme o É causada por uma mutação na qual há substituição de um Glu por uma Val na cadeia β da hemoglobina, levando à formação da hemoglobina S, anormal. Ocorre apenas em indivíduos homozigotos para esta mutação. o Esta mutação provoca uma alteração na estrutura da hemoglobina uma vez que o glutamato é polar enquanto a valina é apolar. Esta substituição provoca a associação anormal das hemoglobinas (por interações hidrofóbicas na parte externa na molécula), o que leva à formação de agregados fibrosos característicos. Isso leva à deformação da célula dos glóbulos vermelhos, ficando estes com forma de foice. o As crises na anemia falciforme são desencadeadas por exercício físico e se caracterizam por fraqueza, tontura, falta de fôlego e aumento da pulsação. O conteúdo de hemoglobina no sangue é de aproximadamente metade do valor normal de 15-16 g/100 mL, devido à fragilidade das hemácias em forma de foice que se rompem facilmente. Os capilares podem ser obstruídos pelas células alongadas causando dores e mal funcionamento de órgãos. ENZIMAS 1) Características  Velocidades de reação muito maiores;  Condições de reação (pH, temperatura, pressão) muito mais brandas;  Alta especificidade de substratos e produtos (não formam produtos secundários); o O sítio de ligação ao substrato consiste em geral de uma cavidade na superfície da proteína que é geometricamente complementar ao substrato. Os aminoácidos do sítio ativo se organizam de maneira a interagirem com o substrato. o Enzimas interagem com seus substratos através de interações fracas: pontes de H, interações eletrostáticas, hidrofóbicas e de van der Waals. Geralmente, após a ligação ao substrato, ocorre ainda um ajuste induzido no sítio ativo da enzima. o Especificidade geométrica: As enzimas apresentam, em geral, especificidade geométrica (ajuste ao sítio ativo). Este grau de especificidade pode variar. Poucas enzimas são específicas para um único substrato. A maioria catalisa reações de substratos correlatos, mas com eficiências diferentes. Algumas enzimas como as digestivas, são mais permissivas aceitando vários tipos de substratos, mas a eficiência da reação enzimática pode variar de acordo com o substrato. o Estereoespecificidade: As enzimas são altamente estereoespecíficas nas reações que catalisam. As enzimas são quirais por natureza (formadas apenas por L-aminoácidos) e, por isso, seus sítios ativos são assimétricos. A tripsina, por exemplo, hidrolisa polipeptídeos formados por L-aminoácidos, mas não tem efeito sobre aqueles formados por D-aminoácidos.  Capacidade de regulação: atividade varia em resposta às concentrações de substratos e produtos. A regulação pode ser feita por controle alostérico, modificações covalentes e variações na síntese das enzimas. o Controle da disponibilidade de enzima: velocidade de síntese x velocidade de degradação. o Controle da atividade enzimática em enzimas regulatórias: controle da afinidade da enzima pelo substrato - Associação de ligantes a enzimas alostéricas: por exemplo, O2, CO2, H + e BPG na hemoglobina - Modificações covalentes: por exemplo, fosforilação.  Maior parte das enzimas são proteínas;  A atividade catalítica depende da integridade da conformação nativa;  Enzimas apresentam uma variedade muito grande de tamanho.  Algumas enzimas necessitam de cofatores (íons metálicos) ou coenzimas (moléculas orgânicas complexas); o Coenzimas: atuam como carreadores transientes de grupos funcionais específicos, a maioria é derivada de vitaminas.  Cofator ou coenzima que são fortemente ligados a uma enzima são chamados de grupos prostéticos;  Enzima + cofator ou coenzima  holoenzima. A parte proteica é chamada de apoenzima ou apoproteína. 1) Enzimas regulatórias  Controlam a velocidade de uma via metabólica. Em vias metabólicas, o produto de uma enzima torna-se o substrato da via seguinte. Isto permite o uso eficiente dos recursos da célula, para aumentar a produção de energia apenas quando isto se faz necessário.  Ajustes na velocidade de reações catalisadas por enzimas regulatórias fazem com que a célula se adapte às suas necessidades energéticas e de biomoléculas. Na maior parte das vias metabólicas multienzimáticas, a primeira enzima da via é uma regulatória. 2) Enzimas alostéricas  Tem sua atividade regulada por moduladores alostéricos, geralmente metabólitos pequenos ou cofatores enzimáticos. Outras enzimas tem sua atividade regulada por modificações covalentes. Ambas possuem normalmente várias subunidades. Em alguns casos, o sítio regulatório e o sitio ativo estão em subunidades diferentes. Há ainda enzimas que são reguladas por clivagem proteolítica e aquelas em que a atividade é estimulada ou inibida quando estão ligadas a diferentes proteínas regulatórias.  Passam por alterações conformacionais induzidas pela ligação de moduladores que podem ser estimulatórios ou inibitórios.eles afetam a atividade de outros sítios da proteína. A ligação do modulador é não covalente e reversível.  Muitas vezes o modulador pode ser o próprio substrato (enzimas homotrópicas) ou diferente do substrato (enzima heterotrópica). o Enzimas alostéricas-inibição por “feedback”: em alguns sistemas multienzimáticos, a enzimas regulatória é inibida pelo produto final da via sempre que a concentração deste produto excede as necessidades da célula. Quando a enzima regulatória é inibida, todas as outras enzimas que catalisam etapas subsequentes são inibidas, devido à menor disponibilidade de seus substratos. NOMENCLATURA DE ENZIMAS  As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam.  Muitas são denominadas pela adição do sufixo –ase ao nome do substrato ou a uma frase que descreva sua atividade (como uréase).  Outras são denominadas por nomes ligados a sua descoberta antes que a reação catalisada fosse conhecida (como pepsina). MECANISMOS DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS 1) Catálise ácido-base: utiliza íons H + ou OH - presentes na água, ou ainda cadeias laterais de aminoácidos. 2) Catálise covalente: uma ligação covalente transiente é formada entre enzima e substrato. Envolve a participação de nucleófilos. 3) Catálise dependente de íon metálico: pode estar ligado à enzima ou ser obtido da solução juntamente com o substrato. Interações iônicas entre metal ligado à enzima e o substrato podem ajudar a orientar o substrato ou estabilizar cargas no estado de transição. Metais podem também mediar reações reversíveis de oxirredução. Obs: a maioria das enzimas utiliza mais de um mecanismo catalítico. CINÉTICA ENZIMÁTICA É a determinação da velocidade da reação catalisada pela enzima e como esta se altera em resposta a pH, concentração de substrato, etc. é o mais importante na caracterização de uma enzima.  Concentração do substrato: medir a velocidade inicial quando a concentração de [S] é muito maior que a de enzima [E].  Mista: O inibidor também se liga a um sítio diferente do sítio ativo, mas liga-se tanto a E quanto a ES.Afeta Km e Vmáx.Na prática, tanto a inibição acompetitiva quanto a mista são observadas apenas para enzimas com dois ou mais substratos. o Irreversível: ligam-se covalentemente ou destroem um grupo funcional da enzima que é essencial à atividade enzimática. -Mecanismo de ação da aspririna: A aspirina inibe a reação catalisada pela cicloxigenase que produz prostaglandinas, responsáveis pelo mecanismo de inflamação e dor. ANTIMETABÓLITOS (VENENOS)  Constituem análogos estruturais de substratos enzimáticos que, ao contrário dos inibidores competitivos, geram produtos. Os produtos são obviamente diferentes dos obtidos a partir dos substratos e não servem de substrato para as enzimas seguintes em vias metabólicas. A conseqüência é a interrupção da via metabólica.  Muitos são de ocorrência natural e constituem mecanismos de defesa de vegetais contra a ingestão de folhas, sementes ou frutos por pássaros, insetos e mamíferos. Muitos são análogos de aminoácidos que são incorporados em proteínas e resultam em formas inativas.  Fluoroacetato é um antimetabólito presente em algumas plantas e que constitui um análogo de acetato. Forma fluoroacetil- coenzima A, inibindo o ciclo de Krebs. (presente em veneno para ratos) TÉCNICAS DE PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS  Tem como objetivo determinar caracteristicas fisicas como peso molecular, ponto isoelétrico e número de subunidades, bem como a natureza do aminoácidos constituintes e sua sequência. 1) Purificação de Proteínas: o Planejamento de um processo de purificação de proteína: o  “Salting in” e “Salting out”: a solubilidade de proteínas é afetada pela concentração de sal de duas maneiras o Em concentrações baixas de sal, a solubilidade de uma proteína aumenta com a [sal] (“salting in”) o Em concentrações mais altas de sal, a solubilidade de uma proteína diminui com o auemnto da [sal]. Quando a concentração de sal é suficientemente elevada, a proteína deve estar quase completamente precipiitada (“salting out”) - devido ao fato de a solubilidade de diferentes proteínas em alta concentração de sal variar bastante, a técnica de “salting out” é bastante usada nas etapas iniciais de purificação de proteínas. - o sal mais usado para esta finalidade é o (NH4)2SO4. 2) Métodos utilizados na lise de tecidos e células: o Liquidificador (quebra tecido conjuntivo e também as células, também pode romper organelas) o Homogeneizador tipo Potter (rompe as células, mas deixa as organelas intactas) o Sonicação Escolha do material de partida Lise das células Precipitação de proteínas contaminantes com (NH4)2SO4 Diálise para retirada de sal 1ª etapa cromatográfica 2ª etapa cromatográfica Proteínas puras o Ciclos de congelamento/descongelamento o Detergentes 3) Métodos de separação de proteínas o Cromatografia - Definições: fase estacionária (matriz sólida porosa); fase móvel (tampãoo, solvente, gás) - Tipos: Coluna; Camada fina; Papel. - Equipamentos: HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) – amostras líquidas; FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) – proteínas em solução; CG (Cromatógrafo a Gás) – amostras volatilizáveis. o Eletroforese - Separação baseada na migração de proteínas carregadas submetidas a um campo elétrico. - No caso de proteínas, utiliza géis de poliacrilamida com ligações cruzadas que funcionam como peneiras moleculares diminuindo a migração das proteínas. Proteínas com relação carga/massa têm um maior atraso na migração. - SDS-PAGE: caso especial em que utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio, que se liga a todas proteínas da amostra conferindo uma carga negativa bastante alta a estas. A carga intrínseca das proteínas passa a ser irrelevante. Como a SDS desnatura as protéinas, todas passam a ter uma forma parecida e a separação ocorre, neste caso ,quase que exclusivamente pela massa da proteína. DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR HPLC Para a detecção dos aminoácidos por HPLC, estes são derivatizados com um composto fluorescente (OPA, o-ftalaldeído). A identificação dos picos de cada aminoácido se dá pela comparação com padrões. Um pico com o mesmo tempo de retenção de um padrão identifica aquele aminoácido.  Clivagem de uma proteína com Tripsina: tripisina cliva proteínas após resíduos de Arg ou Lys  Clivagem de uma proteína com Quimiotripsina: quimiotripsina cliva proteínas após resíduos de aminoácidos aromáticos.  Clivagem de uma proteína com brometo de cianogênio: brometo de cianogênio cliva proteínas em resíduos de metionina.