Tecnicas De DNA RECOMBINANTE

Tecnicas De DNA RECOMBINANTE

A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA. As técnicas de DNA RECOMBINANTE revolucionou o estudo da célula, tornando possível para pesquisadores selecionar qualquer gene á vontade a partir de milhares de genes em uma célula e, após uma etapa de magnificação, determinar a exata estrutura molecular do gene.

Mas como é feito esse processo? Enzimas de restrição: As tesouras moleculares

São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defendê-las de vírus invasores. Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos, levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas, que podem se ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima.

Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a ECORI, produzida pela bactéria Escherichia coli. Essa enzima reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A.

As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento.

Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da sequência GAATTC ao longo de toda sua extensão. Portanto ao contato com a enzima ECORI a fita de DNA pode ser clivada "cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes.

Mas porque essa enzima não atua no DNA da própria bactéria? Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria.

E como se separam estes diferentes pedaços de DNA clivados?

Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel

A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.

A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.

Os fragmentos de DNA menores migram mais rapidamente que os fragmentos maiores.

Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e floresce (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma podem-se localizar as bandas que correspondem ao DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose.

E agora? O que se faz com esses fragmentos de DNA?

Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais gene.

Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína.

O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo, as bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem aos seus “filhos” o seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos milhões de bactérias com o gene. Entretanto é mais fácil manipular, copiar, e purificar esse DNA quando ele é mantido como uma molécula independente, separada do cromossomo bacteriano. Para manter esse DNA “estranho” em uma célula bacteriana, um plasmídeo é utilizado

como VETOR. Os vetores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, a informação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um, particularidades que lhe são próprias. Por exemplo, o plasmídeo cosmídeo e o fago.

Os plasmídeos são moléculas de DNA circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.

Este plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, são utilizados como vetores de clonagem. Para isso, têm que possuir certas propriedades

Ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA que permite a replicação do vector na célula hospedeira;

Possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais únicos de clivagem para enzimas de restrição, os quais constituem o sítio de inserção no vector de clonagem;

transformada de uma não transformada

conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir uma célula

Figura : Plasmídeo. Plasmídeo com sequências que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina.

Apresenta ainda uma origem de replicação (ori) e sítios de restrição para a EcoRI, SalI e PstI. Fonte: Passarge, Color Atlas of Genetics; página 57.

O plasmídeo é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para depois recoloca-lo na bactéria.

A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídeo

bacteriano. O fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídeo se este for clivado com a mesma enzima.

A seguir o plasmídeo clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e a enzima ligase cola os fragmentos de DNA ao plasmídeo, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeir.

A Bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias.

Uma coleção de fragmentos clonados de DNA cromossomal representando o genoma completo de um organismo é conhecida como

Consiste basicamente em

um grupo de bactérias, cada uma carregando um pequeno fragmento diferente de DNA humano.

A hibridização de ácidos nucléicos pode detectar qualquer sequencia de DNA ou RNA em uma biblioteca de cDNA (DNA complementar).

De forma geral existem duas formas para examinar uma biblioteca por forma a identificar os clones que “transportam” um determinado gene ou outra região de DNA de interesse:

1) detecção com uma sonda de oligonucleotídeos que se ligue ao clone de interesse

2) detecção baseada na expressão da proteína que o gene codifica.

a sua detecção e podem ter desde 15 até milhares de nucleotídeos

1- As moléculas de DNA de cadeia simples usadas para detectar sequências complementares designam-se por sondas; estas apresentam radioatividade ou marcadores químicos para facilitar

Inicialmente, a amostra de DNA é desnaturada originando cadeias simples que se ligam a um suporte sólido, geralmente filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon. A membrana é então incubada com uma solução contendo as sondas marcadas radioativamente. Em condições apropriadas (pH aproximadamente neutro, 40-65ºC, 0.3-0.6 M NaCl) a sonda hibridiza com as cadeias complementares. As sondas em excesso, isto é, que não hibridizem, são extraídas e os híbridos são detectados por autorradiografia.

Tendo em conta que, se a sequência (ou parte dela) dos aminoácidos da proteína codificada pelo clone é conhecida, então pode construir-se uma sonda complementar a uma pequena região do gene, baseando-se apenas no código genético. Contudo, como este código é degenerado (alguns aminoácidos são codificados por mais que um codão), uma sonda baseada na sequência de aminoácidos deve incluir todas as possíveis sequências de oligonucleotídeos que teoricamente podem codificar a sequência de interesse. Nesta mistura de oligonucleotídeos está presente a que hibridizará perfeitamente com o clone de interesse.

Comentários