Toxicologia in vitro:Principais modelos utilizados

Toxicologia in vitro:Principais modelos utilizados

Toxicologia Toxicologia in vitroin vitro: : Principais modelos utilizadosPrincipais modelos utilizados

Alexandre Bella Cruz Rilton Alves de Freitas

Objetivo Conhecer Métodos para Avaliação de Genotoxicidade

Conteúdo

Introdução Testes - Micro-organismos

- Eletroforese para célula única em gel (SCGE)

“Teste do Cometa” - Micronúcleo

Toxicologia Toxicologia in vitroin vitro: : Principais modelos utilizadosPrincipais modelos utilizados

Qualidade MP ≠

- Eficácia - Segurança

- Qualidade final

Qualidade MP ≠

- Eficácia

Comprovação de ensaios farmacológicos pré-clínicos e clínicos

- Segurança

Ensaios que comprovem ausência de efeitos tóxicos

- Ausência de contaminantes

Metais pesados, Agrotóxicos, Produtos de degradação, Micro-organismos e metabólitos, etc.

Qualidade MP ≠

- Eficácia

Comprovação de ensaios farmacológicos pré-clínicos e clínicos

- Segurança

Ensaios que comprovem ausência de efeitos tóxicos

- Ausência de contaminantes

Metais pesados, Agrotóxicos, Produtos de degradação, Micro-organismos e metabólitos, etc.

n ensaios toxicológicos GENOTOXICIDADE→n ensaios toxicológicos GENOTOXICIDADE→

Testes de produtos farmacêuticos para a toxicidade genética

União Europeia (1987)

Testes de produtos farmacêuticos para a toxicidade genética

"Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos"

Toxicidade aguda, Toxicidade de doses repetidas (longa duração),

Estudo especial - Genotoxicidade

Testes de produtos farmacêuticos para a toxicidade genética

"Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos"

Estudo especial - Genotoxicidade

1 - Genotoxicidade: Avaliação in vitro da reversão de mutação em bactérias incluindo ativação metabólica ou de dano a cromossomas de células de mamíferos ou de linfoma de camundongo.

2 - Avaliação in vivo do dano em cromossoma em células hematopoiéticas de roedores (teste de micronúcleo).

Relação: Agentes genotóxicos X efeitos nocivos à saúde

- incidência de cânceres - problemas reprodutivos

Ocupacional: laboratórios químicos, clínicos, toxicológicos e indústrias em geral

Agentes químicos: medicamentos, inseticidas, fungicidas, herbicidas, fertilizantes e outros produtos

DNA James D. Watson & Francis Crick (1953)

Não é uma molécula estável

Para “garantir” integridade

Sistemas de reparo Sistemas de tolerância

DNA Lesões (Humanos)

Processos degenerativos (envelhecimento, câncer)

DefiniçõesDefinições

Genotoxicidade:

O estudo dos efeitos adversos de agentes físicos e químicos no material genético de células (DNA ou cromossomos) e a subsequente expressão de tais mudanças.

Mutagenicidade:

Mudança ou dano gênico ou inibição ou dano do mecanismo de reparo ao DNA resultando em uma célula alterada.

DefiniçõesDefinições Mutação:

Processo pelo qual um gene sofre mudança estrutural

Indica mudança fenotípica resultante de um gene mutado

O termo mutante é usado para designar um indivíduo que expressa a alteração do genótipo resultante de mutação

DefiniçõesDefinições Mutação:

É uma mudança na sequência do DNA, que leva a uma alteração herdável da função gênica

Os agentes que mudam a sequência do DNA são “tóxicos” para o gene e são, então, chamados de “genotóxicos”

Genotoxicidade não é uma medida de carcinogenicidade

Indicador para o câncer

Testes de mutagenicidade medem um evento inicial ou intermediário da tumorigênese

Alta associação

Testes de genotoxicidade X Carcinogenicidade Por isso são utilizados avaliação do espectro toxicológico

Vida

DNA (alterações)

Erros durante duplicação

Todos seres vivos Mutação→ Evolução e diversidade das espécies

Agentes mutagênicos Alteração da seqüência das bases (DNA)

Acelera ou aumenta mutações→

Neoplasias (câncer)

Testes de genotoxicidade - Diversas metodologias

- Importante pesquisa para avaliação da toxicidade celular

- Identificar potencial carcinogênico e a mutagenicidade

- Proteger o material genético humano

Genotoxicidade - Sistema experimental (4 Níveis):

Primeiro nível: engloba ensaios moleculares e em bactérias (mutação em gene bacteriano)

Segundo: provas in vitro em células de cultivo (aberrações cromossômicas)

Terceiro: compreende análises in vivo (mutação gênica em células de mamíferos)

Quarto: corresponde a estudos em populações expostas

Genotoxicidade - Sistema experimental (4 Níveis):

Outras técnicas: - coeficiente DNA/proteína

- atividade das enzimas mitocondriais

- proliferação celular

- índices mitóticos

- identificação de danos

- quebras e reparos no DNA

- aberrações cromossômicas

- não disjunções

- a detecção de apoptose e necrose

Sistema de avaliação de novos agentes químicos: Testes de Genotoxicidade !

Sistema apropriado e protocolo: Em construção

Testes

- Micro-organismos - Eletroforese para célula única em gel (SCGE)

“Teste do Cometa” - Micronúcleo

Mutagenicidade Teste de Ames

Bruce Ames, 1970 Cepas (estirpes) Salmonella typhimurium

Mede a indução de mutações reversas em cepas auxotróficas

(His-) para o aminoácido histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem).

Teste de Ames

Resultados de um teste sobre as bactérias têm algum significado Resultados de um teste sobre as bactérias têm algum significado na detecção de agentes tóxicos para os humanos?na detecção de agentes tóxicos para os humanos?

1. A natureza genética e química do DNA é idêntica em todos os organismos

2. Ames e Colaboradores desenvolveram uma forma de simular o metabolismo humano no sistema bacteriano.

Teste de Ames

Mamíferos maior parte do processamento de produtos → químicos ocorre no fígado (onde são decompostos)

Em alguns casos, a ação de enzimas do fígado pode criar um composto tóxico ou mutagênico de uma substância que não era originalmente perigosa.

Ames incorporou enzimas do fígado de mamífero (rato) em seu sistema de teste de bactérias.

Teste de Ames

Realizado em presença e ausência de sistema de metabolização exógeno (mistura S9)

Permite monitorar: - ação direta sobre o material genético

- atividade positiva ou negativa metabólitos biotransformação Semelhante o que ocorreria nos fígados de mamíferos.

Culturas auxotróficas (exigência nutricional) Culturas auxotróficas (exigência nutricional)

Teste de Ames

Fundamenta-se na restauração ou compensação de um defeito genético específico que causa exigência a um determinado nutriente.

A frequência de mutação reversa é facilmente medida pela contagem do número de colônias que crescem em meio mínimo após exposição de uma população a um agente mutagênico.

Teste de Ames - Procedimento Teste de Ames - Procedimento

Teste de Ames - Procedimento Teste de Ames - Procedimento

Teste de Ames - Índice de Mutagenicidade Teste de Ames - Índice de Mutagenicidade

IM = 1,0 (indica não houve indução de revertentes) IM entre <0,6 e 0,7 (pode ser indicativo de toxicidade) IM > 1,0 (pode indicar indução de revertentes) IM ≥ 2,0 (substância considerada mutagênica)

Fonte: Invitox, 2004; Borgo, Rosa, Vargas, 2004; Jayaprakasha, Negi, Jena, 2006 n. revertentes induzidos n. revertentes espontâneos IM =

Teste de Ames - Índice de Mutagenicidade

Mutagenicidade Teste alternativo: Sacchamomyces cerevisiae

Levedura (fungo unicelular) - Eucorioto

Ferramenta importante em pesquisas - mutagenicidade

- reparo de DNA

- mecanismos estresse oxidativo

Complementam os ensaios realizados em bactérias

Teste de mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14c)

Dano genético Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Rydberg & Johanson: Quantificação danos DNA em células em agarose

- detecta lesões genômicasmutação→

- não detecta mutações

- Lesões genômicas são passível de correção .'. estudo de reparo do DNA

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Rydberg & Johanson: Quantificação danos DNA em células em agarose

Danos DNA são célula e tecido-específicos .'.

Permite detecção danos e reparo em uma única célula Relevante para avaliação de compostos genotóxicos.

Cometa - Vias de reparo DNA

- reversão da lesão - reparo por excisão

- reparo recombinacional

- tolerância a lesões

Atuam em conjunto garantir a manutenção genética→ (sobrevivência dos organismos)

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE) Procedimento

1- Células embebidas em gel de agarose (lâminas)

2- Lisar sob condições alcalinas (ou neutras)

3- Eletroforese

4- Segmentos DNA livres migram fora do núcleo→

5- Observação microscópica 6- Classificação das células em classes (0-4)

Teste cometa com vários graus de dano ao DNA:

A - célula sem dano B - célula com leves danos C - célula danificada ou clássico cometa D - célula altamente danificada

Fonte: Lebailly et al. Occup Environ Med, 60: 910-917, 2003.

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE) Tipo de dano detectado

Fonte: Junqueira, A.P.F., 2006

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE) Condições de ensaio

Teste do Micronúcleo

Ensaio in vivo →para a detecção de agentes

- clastogênicos

(quebram cromossomos);

- aneugênicos (induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal)

Teste desenvolvido em eritrócitos de medula óssea (camundongos, ratos)

Teste do Micronúcleo Procedimento

1- Camundongos jovens machos (4-5 semanas)

Grupos 10

Controle positivo: ciclofosfamida 50 mg/kg Controle negativo Teste Dieta, Temp. Umidade, Ciclo de luz

2- Administração substância (12 - 30 h)

3- Sacrificio (medula óssea fêmur, lava, centrifuga 1000 rpm / 5 min.) 4- Sedimento (duas lâminas, seca ambiente)

Teste do Micronúcleo Procedimento

5- Coloração Leishmann

6- Microscopia de fluorecência

7- Contagem dos eritroblastos policromáticos com micronúcleo em relação ao total (mínimo 1000 EP/lâmina)

Pode ser corado com Giemsa ou fluoresceína

Teste Micronúcleo Teste Micronúcleo

Teste de carcinogenicidade in vivo Empregando roedores→ in vitro Transformação celular BALB/C3T3 (OEDC)*→

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