Aula Biossegurança6

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Victor A. Marin

Culturade Tecidosde Plantas

A cultura de tecidos permite o crescimento e/ou desenvolvimento de células de plantas, tecidos ou órgãos em um meio nutritivo artificial. Geralmente, a cultura é axênica. Os tecidos das plantas são mantidos em meio de cultura por um período específico de tempo e é transferido para meio fresco periodicamente, ou para um diferente meio, alterando a via de desenvolvimento.

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Totipotência

Asplantas podemsergeradasdeuma única célula não reproduzível, podendo estaserretiradadefolha,caule ou raíz e produzindo u ma plantainteira.

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Meio de Cultura

•Componentes do meio

–Macronutrientes: C, H, O, P, K, N, S, Ca, Mg –Micronutrientes: Fe, Mn, Zn, Cu, Bo, Mo, Cl

–Fontede energia: sacarose

– Vitaminas: vitaminas B

–Meio: agar + água= sólido

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•Outros componentes

–desenvolvimento e diferenciação

• Auxinas: enraizamento • Citocininas: brotamento

• Giberelinas: alongamento

•Ácido abscísico: dormência da semente

•Etileno: amadurecimento, mortedo tecido

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Propagação através da cultura de tecidos de violeta http://w w w.jmu. edu/biology/biofac/facfro/cloning/cloning. htm Michael H. Renfroe

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Cultura de Tecidosde Plantas OU

E mbriogênese Organogênese

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Genes marcadores e genes reporters

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Green Fluorescent Protein (GFP)

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Exemplos

Soja“Roundup Ready”

O herbicidaglifosatoé normalmente tóxicoas plantas, mas a adição de um determinadogene permitequea planta transgênica sobreviva a concentrações superiores de glifosato.

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5-enolpiruvinilchiqui mato 3-fosfato sintase

Esta enzimafazpartedavia do chiquimato. EPSPS é críticanasíntesede tirosina, fenilalaninae triptofano. Existem atual mente11 enzi mas que são requeridas paracompletara via do chiquimato.

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Roundup Ready Technology Eritrose-4-P + PEP

Monsanto web site

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Victor A. Marin Soja“Roundup Ready”

Monsanto web site

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ESTUDO DA PROTEÍNA EXPRESSA (Harrison et al., 1996)

Comparação entre a proteína do microorganismo doador e a expressa na planta.

Estudos com ratos e patologia geral.

Avaliação da digestão da proteína expressa por Western blot.

Avaliação da digestão in vitropor atividade enzimática.

Homologia do sequenciamentode aminoácidos.

Quantificação da proteína.

Carboidratos associados a proteínas.

Aminoácidos derivados de feniltioidantoína. Atividade funcional.

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GRÃOS DE SOJA E DERIVADOS (Padgette et al., 1996)

Composição centesimal (proteínas, gordura, fibra, cinzas, carboidratos e umidade)

Aminoácidos (incluindo aromáticos)

Ácidos graxos

Atividade ureática Inibidor de tripsina

Grãos, Farinha tostada e não tostada e Isolado e concentrado protéico

Lectina

Isoflavonas

Fitatos

Estaquiose e rafinose

Atividade ureática

Solubilidade de Nitrogênio

Óleo (refinado, branqueado e desodorizado)

Ácidos graxos Lecitina bruta Conteúdo de aminoácido/proteína

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ANIMAIS (Hammond et al., 1996)

Ganho de peso Medidas do pâncreas Avaliação de patologias gerais Consumo de ração Expectativa de vida Gordura Produção de leite Composição do leite Contagem de células somáticas Digestibilidade aparente Matéria seca ingerida Energia ingerida Consumo de Nitrogênio Nitrogênio (fecal e urinário)

Ácidos graxos voláteis do rúmen e N2 amoniacal

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ESTUDOS DE ALERGENICIDADE e

Verificação da fonte do gene

Comparação da composição e quantidade relativa dealergênicos endógenos

Comparação das propriedades físico-químicas e bioquímicas com proteínasalergênicasconhecidas (estabilidade ao calor, estabilidade ao processamento, sequenciamento de aminoácidos, nível em relação ao teor total de proteína, etc).

Ensaios invitroe in vivo - Ratos

-Ensaios Immunoblotting

- Ensaios Skin-prick test

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Ultrastructural morphometrical and immunocytochemical analysesof hepatocyte nuclei from mice fed on genetically modified soybean.

Malatesta M, Caporaloni C, Gavaudan S, Rocchi MB, Serafini S, Tiberi C, Gazzanelli G.

Ultrastructural analysisofpancreatic acinar cells from mice fed on genetically modified soybean

ManuelaMalatesta, Chiara Caporaloni,LuigiaRossi, Serafina Battistelli, Marco B. L.Rocchi, Francesco Tonucci and Giancarlo Gazzanelli

Victor A. Marin

European Journalof Histochemistry2003; vol. 47 issue4 [Oct-Dec]: 385-388

Fine structural analysesof pancreatic acinar cell nuclei from mice fed on genetically modified soybean

M. Malatesta, M. Biggiogera, E. Manuali, M.B.L. Rocchi, B. Baldelli, G. Gazzanelli

European Journalof Histochemistry2004; vol. 48 issue4 (Oct-Dec):449-454

Ultrastructural analysisof testes from mice fed on genetically modified soybean

L. Vecchio, B. Cisterna, M. Malatesta, T.E. Martin, M. Biggiogeraz

EuropeanJournalof Histochemistry2005; vol. 49 issue3 (Jul-Sep): 237-242. Reversibilityofhepatocytenuclearmodificationsinmice fed on genetically modified soybean.

Malatesta M., Tiberi C., Baldelli B., Battistelli S., Manuali E., Biggiogera B.

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Histochem cell Biol2008 Jul 2. A long-term study on female mice fed ona genetically modified soybean:effects on liver ageing.

Malatesta M, Boraldi F, Annovi G, Baldelli B, Battistelli S, Biggiogera M, Quaglino D.

Arch EnvironContamToxicol. 2007May;52(4):596-602.New analysisof arat feeding study withagenetically modified maize reveals signsofhepatorenal toxicity. Séralini GE, Cellier D, de Vendomois JS.

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Tomate“FLAVR SAVR”

•O amadurecimentodas frutasé causado emparteporenzimas como a poligal ac turonas e

•A inibição da atividade da poligalacturonasepela expressão do RNAm antisense impede esteprocesso

•O tomate “FLAVR SAVR” foio primeiro ali mento geneticam ente engenheirad o ap rovad o par a consu mo hu man o nos E.U.A. (1994)

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PlantasResistentes a Vírus

As plantaspodemser “imunizadas” pela expressão antisense da proteínada capa proteica do vírus

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Victor A. Marin Vetores de Clonagem

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Bacillus thuringiensis (BT)

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