Espectrômetros e Espectrofotômetros

Espectrômetros e Espectrofotômetros

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Espectrometria e Espectrofotometria

Espectrometria e Espectrofotometria:

Espectrometria e Espectrofotometria são, ambas, técnicas que a maioria dos cientistas precisam recorrer em algum momento de suas carreiras. Quer para a confirmação da identidade de um composto, ou para a quantificação de uma proteína, a espectrofotometria no espectro ultravioleta e no espectro visível, tem encontrado rapidamente crescente numerosas aplicações em campos dentro dos últimos anos.

Entre ambas existe uma sutil diferença apenas, no entanto, para entendê-la, precisamos verificar que a espectrofotometria teve que percorrer um longo caminho desde que o Dr. Arnold Beckman construiu o primeiro dispositivo original na década de 1940.

A Espectrometria é um método para medir a quantidade de luz que uma substância química absorve por meio da medição da intensidade luminosa de um feixe de luz que passa através da solução amostra.

O funcionamento consiste no princípio básico de que cada composto químico absorve ou transmite a luz ao longo de um determinado intervalo de comprimento de onda. Esta medição pode também ser usada para medir a quantidade da concentração de uma substância química conhecida.

Espectrometria é um dos métodos mais úteis de análise quantitativa em diferentes áreas, como química, física, bioquímica, engenharia de materiais e química e aplicações clínicas.

Princípios e Aplicações:

Espectrometria é amplamente utilizada para análise quantitativa em várias áreas (por exemplo, química, física, biologia, bioquímica, engenharia de materiais e produtos químicos, aplicações clínicas, aplicações industriais, etc). Qualquer aplicativo que lida com substâncias químicas ou materiais pode usar esta técnica.

Em bioquímica, por exemplo, é usado para determinar reações catalisadas por enzimas. Em aplicações clínicas, é utilizado para examinar o sangue ou tecidos para diagnóstico clínico. Há também diversas variações de espectrofotometria como espectrofotometria de absorção atômica e espectrofotometria de emissão atômica.

Todo composto químico absorve, transmite ou reflete a luz (radiação eletromagnética) dentro de um determinado intervalo de comprimento de onda. Espectrofotometria é uma medida de quanto uma substância química absorve ou transmite o espectro de luz.

Um espectrômetro é um instrumento que mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvidos de um feixe de luz após ele ter passado através de solução de amostra. Com o espectrofotômetro, a quantidade de uma substância química conhecida (concentrações) também pode ser determinada pela medição da intensidade de luz detectada. Dependendo da gama de comprimento de onda da fonte de luz, que podem ser classificados em dois tipos diferentes:

•Espectrômetro UV - visível: usa a luz na faixa ultravioleta (185 - 400 nm) e faixa do visível (400 - 700 nm) do espectro de radiação eletromagnética.

•Espectrômetro IR (infravermelho): usa a luz na faixa do infravermelho (700 - 15000 nm) do espectro de radiação eletromagnética.

Em espectrometria visível, a absorção ou a transmissão de uma determinada substância pode ser determinada pela cor observada. Por exemplo, uma amostra de solução que absorve a luz sobre todas as gamas visível (isto é, transmite nenhum dos comprimentos de onda visíveis) aparece preto em teoria.

Por outro lado, se todos os comprimentos de onda visíveis são transmitidos (isto é, absorve nada), a amostra solução parece branca.

Se uma amostra de solução absorve a luz vermelha (~ 700nm), parece verde porque o verde é a cor complementar do vermelho. Espectrofotômetros visíveis, na prática, usam um prisma para afinar a uma certa gama de comprimento de onda (para filtrar outros comprimentos de onda) de modo que um feixe de determinado comprimento de luz em particular, é passada através de uma amostra de solução.

Dispositivos e Mecanismos do Sistema:

Para produzir os dados referentes as leituras desejadas, várias coisas precisam acontecer no interior do espectrômetro. Em primeiro lugar, uma fonte de luz gera luz num comprimento de onda específico ou comprimentos de onda. A Figura a seguir ilustra a estrutura básica de um espectrômetros. É constituída por uma fonte de luz, um colimador, um monocromador, um seletor de comprimento de onda, um tubo de ensaio de solução de amostra, um detector fotoelétrico, e um mostrador digital:

Assim, num conceito tradicional (porém não mais atual) um espectrofotômetro, em geral, consiste na combinação de dois dispositivos: um espectrômetro e um fotômetro.

Espectrômetro:

Um espectrômetro é usado em espectroscopia para a produção de linhas espectrais indicando os seus comprimentos de onda. Espectrômetro é um termo que é aplicado aos instrumentos que operam sobre uma gama muito ampla de comprimentos de onda. Em geral, qualquer instrumento em particular irá operar sobre uma pequena porção deste intervalo total por causa dos diferentes técnicas utilizadas para medir diferentes porções do espectro.

Produz uma gama desejada de comprimento de onda de luz. Primeiro um colimador (lente) transmite um feixe reto de luz (fótons) que passa por um monocromador (prisma ou grade de difração) para dividi-lo em comprimentos de onda componentes diversos (espectro). Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) permite que seja transmitida apenas os comprimentos de onda desejada, como mostrado na figura anterior.

Fotômetro:

Num conceito que atualmente se encontra um tanto quanto ultrapassado, o fotômetro, por sua vez, indica, tão somente, detector fotoelétrico que realiza a medição da intensidade da luz.

Com os espectrômetros mais antigos só se podia fazer medições fazendo passar pela amostra do composto um comprimento de onda específico de cada vez e o monocromador era acionado manualmente, a fim de variar o ângulo de posicionamento do monocromador e mudar, assim, o comprimento de onda que incidia sobre a fenda de passagem. Os instrumentistas precisam ter uma grande habilidade, além de conhecimentos específicos para determinar as faixas em que as medidas deveriam ocorrer.

Após o intervalo desejado de comprimento de onda da luz passar através da solução de uma amostra em um tubo de ensaio, o fotômetro detecta a quantidade de fótons que é absorvida e, em seguida, envia um sinal para um galvanômetro ou um mostrador digital, tal como foi ilustrado.

É necessário que um espectrômetro produza uma vasta variedade de comprimentos de onda porque diferentes compostos absorver melhor a comprimentos de onda diferentes. Todavia, num conceito moderno, é ai que entra a diferença entre um espectrômetro e um foto espectrofotômetro:

Um simples espectrômetro faz a difração da luz branca antes dela passar pela amostra do composto e portanto, fará a leitura de simplesmente um único comprimento de onda, utilizando como elemento sensor um único fotodiodo. Já, por sua vez, um espectrofotômetro faz a difração da luz após ela passar através de uma amostra, permitindo a utilização de um Detector de Arranjo, para ler, simultaneamente, a intensidade luminosa transmitida em comprimentos de onda múltiplos.

Quanto a compostos a serem analisados, por exemplo, P-nitrofenol (forma ácida) tem a absorvância máxima a aproximadamente 320 nm e P-nitrofenolato (forma básica) melhor absorver a 400nm,

Espectrofotômetro E-225D da CELM produto com projeto 100% nacional que foi ao mercado em 1989.

como mostrado na figura a seguir:

Olhando para o gráfico que mede absorvância e comprimento de onda, um ponto de isosbéstico também pode ser observado. Um ponto de isosbéstico é o comprimento de onda no qual a absorvância de duas ou mais espécies de compostos são as mesmas. O aparecimento de um ponto de isosbéstico numa reação demonstra que um intermediário não é necessário para formar um produto a partir de um reagente. A figura a seguir mostra um exemplo de um ponto de isosbéstico:

A presença de um ponto de isosbéstico tipicamente indica que apenas duas espécies, que variam em concentração contribuem para a absorção em torno do ponto isosbéstico. Se uma terceira espécie está participando no processo, os espectros tipicamente se intersectam em diversificados comprimentos de onda com a variação de concentrações, criando a impressão de que o ponto de isosbéstico está 'fora do foco', ou que vai deslocar as mudanças nas condições. A razão para isto é que seria muito improvável para três compostos terem coeficientes de extinção ligados numa relação linear para o acaso para um comprimento de onda particular.

Referindo novamente a figura anterior, a quantidade de fótons que passam através do tubo de ensaio e seguem para o detector é dependente do diâmetro do tubo de ensaio e da concentração da amostra. Uma vez que se conheça a intensidade da luz do feixe após ter passado através do tubo de ensaio, pode-se relacionar com a transmitância (T). Transmitância é a fracção da luz que passa através da amostra. Isto pode ser calculado usando a equação:

Onde It é a intensidade da luz após o feixe de luz ter passado através do tubo de ensaio e Io é a intensidade da luz antes de o feixe de luz passar através do tubo de ensaio. Transmitância está relacionada com a absorção pela expressão:

Onde a absorvância representa a quantidade de fótons que é absorvida. Com a quantidade de absorvância conhecida a partir da equação acima, é possível determinar a concentração desconhecida da amostra usando a Lei de Lambert-Beer. A figura a seguir ilustra a transmitância da luz através de uma amostra. O comprimento é utilizado para Lei de Lambert-Beer descrito abaixo.

Lei de Beer-Lambert:

Lei de Lambert-Beer (também conhecida como Lei de Beer) afirma que existe uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma amostra. Por esta razão, a Lei de Beer pode ser aplicada apenas quando há uma relação linear. Lei de Beer é escrita como:

onde A é a medida de absorvância (sem unidades), e é o coeficiente de extinção molar ou absortividade molar (ou coeficiente de absorção), l é o comprimento do caminho (diâmetro do tubo do tubo de ensaio), e c é a concentração.

O coeficiente de extinção molar é dado como uma constante e varia para cada molécula. Como a absorbância é uma grandeza adimensional (não tem unidade de medida), a unidade de e deve cancelar as unidades tanto de comprimento, quanto de concentração.

Como resultado, e tem as unidades: L . mol-1 . cm-1

O comprimento do percurso é medida em centímetros e um espectrômetro padrão usa um tubo de ensaio que é de 1 cm de diâmetro. Uma vez que A, e, e l são conhecidos, pode-se calcular a concentração c da amostra.

Exemplo de Solução de Aplicação:

(1)Ao longo de todo espectro medido (320 a 1000 nm) a Guanosina tem uma absorvência máxima em 275 nm. 275 = 8400 M-1 cm-1 e trajeto do feixe pela solução é de 1 cm. Usando um espectrofotômetro, descobre-se que 275= 0.70. Qual é a concentração da guanosina?

Para resolver este problema, precisamos usar a Lei de Beer.

O Espectrofotômetro Moderno:

Os circuitos que comandavam e realizavam as leituras, em equipamento mais antigos, eram todos baseados em circuitos integrados (Cis) de eletrônica digital MSI (média escala de integração) e costumavam combinar o poder das lógicas de tecnologias TTL e CMOS, além de empregar, também, Cis puramente analógicos, contendo amplificadores operacionais. Porém, com os avanços da automação e da microeletrônica, uma série de progressos foi possível.

Num primeiro momento, com o emprego dos microprocessadores e inicialmente pelo emprego de voice coil e, posteriormente por emprego de pequenos servo posicionadores rotativos e de motores de passo, pôde-se automatizar o movimento para posicionamento angular do monocromador. Posteriormente, os espectrômetros passariam a ser integrados aos microcomputadores, dando ao sistema ainda maior versatilidade. Todavia, devido a questões de tradição do público usuário de tais instrumentos, tais inovações ocorreram relativamente tarde, se comparado com equipamentos destinados a outras áreas de aplicações e, mesmo hoje, a opção de movimento manual do monocromador ainda é mantida.

Atualmente, um Direct Drive Digital é simples e confiável, baseado em um motor de passo controlado por microprocessador próprio e movendo-se em incrementos de comprimento de onda tão pequenos quanto .01 nm por passo, estando ligado diretamente ao grating por um arranjo de parafuso de roda sem-fim, possibilitando variação de posicionamento automático com grande precisão e robustez.

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