Imunodifusão Radial Dupla, Microprecipitação e Tipagem Sanguínea

Imunodifusão Radial Dupla, Microprecipitação e Tipagem Sanguínea

IFRJ – Campus Maracanã

Coordenadoria de Biotecnologia

Disciplina: Imunologia

Turma: BM161

Professores: Rodrigo Bisaggio e Dolcydete Biscaya

Relatório de Imunologia

Imunodifusão Radial Dupla, Microprecipitação e Tipagem Sanguínea

Avaliação:

Critério:

Nota:

Apresentação

Introdução

Objetivos

Material Utilizado/ Métodos

Resultados

Discussão

Conclusão

Referências Bibliográficas

Total:

Bancada: 3

Alunos: Alexandre Garcez

Larissa Rodrigues

Paulo Rezende

Sabrina Fausto

Rio de Janeiro, 19 de outubro de 2010.

  1. Introdução

O Imunodiagnóstico é o método pelo qual pretende-se descobrir agentes causadores de enfermidades para seguidamente poder se propor um tratamento adequado. Há muitos métodos pelos quais pode-se fazer um Imunodiagnóstico, e o mais simples deles é chamado de exame clínico, onde o profissional em saúde procura por sinais e sintomas que podem indicar a natureza daquela doença.

Sinais são, por definição, alterações no metabolismo, aspecto de um indivíduo e sua conformação física que podem ser percebidas pela visão, ou devidamente mensuradas pelo médico ao qual o realiza. Sintomas, entretanto, tem como diferença com os sinais por apenas o paciente poder percebê-lo, havendo, portanto, uma dependência de seu relato para que o doutor possa tomar conhecimento do mesmo, e por conta dessa dependência é comumente dizer que sintomas têm, por vezes, veracidade questionável.

A Anamnese, geralmente realizada anteriormente ao exame clínico, é uma entrevista na qual utiliza-se técnicas de forma a procurar indícios fatídicos que se relacionem a doença a ser diagnosticada, ao doente, ou aos sinais já observados.

Em caso de uma doença causada por infecção, pode-se isolar o agente causador com o intuito de fazer cultura e realizar testes bioquímicos que o identificariam, com taxa de erro mínima, podendo-se em seguida ter uso de um tratamento adequado. O problema do isolamento de agentes causadores é o local onde este está instaurado, muito embora também haja dificuldades para a cultura de alguns vírus. Em infecções na pele, ou outros lugares mais superficiais do canal auditivo ou cavidade oral é possível fácil isolamento com o uso de um SWAB, porém em órgãos internos é preciso de procedimentos invasivos, como uma biópsia, o que torna por vezes o procedimento inviável.

Desta forma se iniciou a identificação de anticorpos, no sangue, como método de Imunodiagnóstico. É sabido que durante a resposta imunológica do organismo contra um patógeno qualquer, caso se instale por tempo suficiente, pode haver a participação de Linfócitos B para seu combate. Este tipo de célula tem uma especificidade quanto ao reconhecimento do patógeno, assim como a produção de fatores que agem para sua destruição: os anticorpos. Tendo-se os anticorpos é então possível a realização de técnicas onde, em sua maioria, utiliza-se um agente patogênico previamente existente em laboratório para verificar a possibilidade de interação deste com o anticorpo, caso esta ocorra o agente causador da enfermidade é comprovado, muito embora haja outros fatores como a concentração utilizada do anticorpo e antígeno que irão influenciar o resultado, podendo assim apresentar um resultado negativo ou de difícil observação mesmo que haja a interação.

Entre as técnicas mais utilizadas nos dias atuais são a microprecipitação, a imunodifusão, a hemoaglutinação, a fixação de complemento, o método ELISA, a imunofluorescência e o método de Western-Blot, neste relatório abordaremos as duas primeiras.

Na microprecipitação é incubado em um tubo um antígeno e o anticorpo específico para ele, onde estes, se em concentração apreciável estiverem (o mais próximo possível do equilíbrio de concentrações), reagem entre si, formando um complexo antígeno-anticorpo e tornando-se menos solúveis para então precipitarem. Caso a precipitação seja observada então já têm-se a identificação do antígeno. Essa propriedade é possível graças a capacidade dos anticorpos de se ligarem a dois antígenos, interligando-os, e como em um antígeno ainda pode-se ligar mais anticorpos, a agregação desse imunocomplexo e a diminuição de sua solubilidade é possível.

Na imunodifusão nos enfocaremos na Imunodifusão Dupla de Ouchterlony, que é um método realizado em agarose que possui furos onde é colocado separadamente o soro e o antígeno. O soro e o antígeno se difundem ambos pelo ágar formando uma linha de precipitação no local onde encontram-se, esta poderá ser observada após o tempo de incubação, comprovando assim a especificidade entre os dois. É possível ainda nesse método utilizar diferentes concentrações do soro o que permite não só um melhoramento no método, onde diminui a possibilidade de resultados negativos mesmo ocorrendo-se a precipitação, como também ajuda para mensurar a quantidade de antígeno na amostra. Também é possível a utilização de diferentes antígenos nos furos para poder saber com qual os anticorpos do soro precipitarão.

Na prática que foi realizada ainda houve um ensaio com antígenos presentes no sangue, estes que definem, pelo sistema AB0 se o indivíduo será do tipo sanguíneo A, B, AB ou O, além disto também pretendia-se definir o Rh + ou Rh através do antígeno D existente em maior concentração em pessoas que são definidas como Rh +. Neste sistema temos que a presença do antígeno A no sangue também leva a produção de anticorpos contra o antígeno B, que no caso seria um “corpo estranho” ao organismo. Com o antígeno B ocorre o mesmo sendo que agora temos a produção do Anti-A. Enquanto que a ausência de ambos os antígenos, onde a pessoa seria definida como tipo sanguíneo O, há a produção tanto do anti-B, como anti-A, e vice versa para uma pessoa que seja do tipo AB, onde não há produção de anticorpos ligados ao sistema AB0. Já no caso do Rh temos que uma pessoa Rh reagiria com a presença do antígeno D, pois produz o anticorpo Anti-D. Um dos motivos pelo qual essas informações são importantes é para transfusões de sangue, onde é importante que não haja uma rejeição e resposta imunológica contra este. Pessoas com o tipo sanguíneo O, pela falta de antígenos A e B, podem doar sangue para qualquer outro individuo, enquanto pessoas AB recebem este de pessoas de qualquer tipo sanguíneo. Tipos sanguíneos A, recebem além do O também do seu próprio (A), e o mesmo raciocínio se aplica com o tipo sanguíneo B. Também vale ressaltar que há importância em Rh + doarem para Rh +, sendo o mesmo no caso dos Rh -.

Outro motivo pelo qual essa informação é importante é a definição do tipo sanguíneo de alguém em laboratório, onde, caso haja aglutinação dos anticorpos anti-D, anti-A ou anti-B com as gotas de sangue utilizadas para o ensaio é porque nesta tem os respectivos antígenos que formam imunocomplexos com estes anticorpos.

  1. Objetivos

  • Objetivos gerais:

Observar a competência dos anticorpos para a aglutinação e precipitação de antígenos específicos que reajam com eles.

  • Objetivos específicos:

Imunodifusão: Obter uma região de linha branca entre os poços do antígeno e anticorpo, para poder estipular quais concentrações destes tem-se um precipitado máximo (ponto de equivalência)

Microprecipitação: Observar a formação de precipitado dentro de um tubo capilar

Identificar o grupo sanguíneo e o Rh: a Partir da aplicação de soros anti A ou B e soro para Rh, visualizar a aglutinação e a partir destas determinar o grupo sanguíneo da pessoa.

  1. Material Utilizado e Métodos

  • Material Utilizado:

Materiais

▪Tubo para micro-centrífuga do tipo “eppendorf” (1,5mL)

▪Luvas descartáveis de látex para procedimento

▪Capilares

▪Massa de modelar

▪Ágar fundido

▪Lanceta estéril

▪Lâminas

▪Papel toalha

Reagentes

▪Soro sanguíneo obtido de camundongos imunizados

▪Anticorpo monoclonal anti-A

▪ Anticorpo monoclonal anti-B

▪ Anticorpo anti-D

▪Proteína ovalbumina 100mg/mL

▪Álcool 70%

Equipamentos

▪Micro-pipeta automáticas p200 Gilson®

▪Banho-Maria

▪Bomba a vácuo

▪Pipetas de 10,0 mL

  • Métodos:

Imunodifusão Radial Dupla:

Com o auxílio de uma pipeta, aplicou-se uniformemente sobre uma lâmina de vidro aproximadamente 7,0 mL do ágar fundido, sem que o deixasse extrapolar os limites da lâmina e ficasse com uma altura razoável para a aplicação posterior de líquidos. Atentando-se para o fato, de que se houvesse acúmulo de ágar solidificado no interior da pipeta, necessitava-se rinçar com água fervente para a remoção do mesmo. Aguardou-se até que houvesse a ressolidificação do ágar sobre a lâmina e posteriormente, com auxílio de uma pipeta Pauster modificada (o aro de sucção era maior do que o de uma comum) acoplada a uma bomba de vácuo fez-se cinco cortes circulares, sendo um central e os outros quatro distribuídos equidistantes uns dos outros ao redor do central, obedecendo-se ao modelo previamente estipulado.

Com os furos prontos, as lâminas foram posicionadas em uma placa de Petri, uma do lado da outra e nas bordas da placa pôs-se gazes umedecida.

Com as lâminas numa placa de Petri, adicionou-se nos poços centrais o antígeno, em cada furo adicionou-se uma concentração diferentes (0,1mg/mL e 1mg/mL) e nos furos ao redor foram adicionados pequenas quantidades do soro, cada um com uma concentração distinta, na ordem, soro concentrado, a diluição 1:10, a 1:100 e a 1:1000 ocupando cada um, um dos quatro poços.

Uma vez concluída as aplicações, deixou-se as placas de Petri acomodadas para os para que os resultados pudessem ser observados no dia seguinte.

Microprecipitação:

Com o auxílio de uma micropipeta adicionou-se a quatro capilares distintos cerca de 30μL de proteína ovalbumina, em dois deles utilizou-se ovalbumina 10mg/mL e nos outros dois a concentração utilizada da proteína foi de 1mg/mL. Ainda utilizando a micropipeta, adicionou-se aos mesmos capilares em seguida cerca de 30μL de soro sanguíneo obtido de camundongos imunizados, dois capilares receberam soro concentrado e dois receberam soro diluído cujo fator era 1:10. As soluções foram adicionadas aos capilares de modo que nenhum capilar tinha as mesmas concentrações das duas substâncias em relação a outro. Após receberem as substâncias os capilares eram espetados numa tira de massa de modelar aderida à bancada. Aguardou-se cerca de 30 minutos e os capilares então foram observados e os resultados obtidos foram anotados.

Tipagem Sanguínea:

Utilizando uma lanceta estéril, foram retiradas três gotas de sangue do dedo indicador direito de um voluntário. Estas gotas foram postas uma ao lado da outra em uma lâmina. Então, rapidamente para evitar a coagulação, adicionou-se uma gota do anticorpo monoclonal anti-A (coloração azul), do anticorpo monoclonal anti-B (coloração amarela) e do anticorpo anti-D (incolor), um em cada gota de sangue. Para a melhor visualização dos resultados, moveu-se a lâmina sutilmente, com cuidado para os conteúdos não escorrerem ou se misturarem.

  1. Resultados

  • Imunodifusão Radial Dupla:

Em nenhum dos casos foi possível identificar algo diferente, como uma linha de precipitação entre o furo central e algum periférico.

  • Microprecipitação:

Após a espera, os quatro capilares foram verificados e observou-se que em três deles a solução se manteve incolor e em um - o que continha ovalbumina 1mg/mL e soro concentrado - a solução se tornou levemente turva.

  • Tipagem Sanguínea:

Observou-se aglutinação das gotas de sangue as quais foram adicionados os anticorpos Anti-B e Anti-D, o que caracterizou o sangue do voluntário como sendo do tipo B e Rh positivo.

Nada foi observado na gota a qual foi adicionado o anticorpo Anti-A.

  1. Discussão

  • Imunodifusão Radial Dupla:

O esperado para esta prática era que ocorresse a formação de uma linha de precipitação entre o furo central e algum periférico para poder-se estipular, a partir das concentrações de soro e antígeno adicionadas, quais concentrações seriam observadas precipitação máxima, ou seja, uma linha esbranquiçada mais turva e larga (com mais precipitado).

Pode-se ter acontecido de não ter a precipitação, ou pela falta do anticorpos, ou porque a linha formada não foi possível ser visualizada a olho nu, devido a muito pouca precipitação, ou a um excesso de anticorpos para poucos antígenos, efeito conhecido como prozona. Porém, como na prática de microprecipitação ocorreu em um dos tubos à precipitação, pode-se descartar a primeira hipótese.

A todo o momento diz-se precipitação, este termo está sendo utilizado, pois o antígeno em questão tratasse de uma solução, ou seja, o material (ovoalbumina) a reagir com os anticorpos estão solubilizados e como produto dessa reação, há formação de grandes complexos anticorpos-antígenos, o que acaba diminuindo a camada de solvatação e esta torna-se insuficiente. Este termo distingue da aglutinação, pois essa tratasse de partículas em suspensão e não de solução.

Durante o tempo de incubação, os antígenos no extrato da amostra e os anticorpos difundem-se para fora dos seus respectivos poços. Quando as duas frentes de difusão se encontram, se qualquer um dos anticorpos reconhecem qualquer um dos antígenos, há a formação como já foi dto do que é conhecido como complexo imune. Isso precipita complexos imunes no gel para que formam uma fina linha branca, que é uma assinatura visual de reconhecimento de antígeno.

A precipitação ocorre com o antígeno pois este apresenta diversos epítopos diferentes (ou seja, tem várias micro-regiões antigênicas por molécula para que os anticorpos possam se ligar). Os anticorpos presentes no soro extraido do animal têm pelo menos dois sítios de ligação do antígeno (e no caso da IgM por exemplo, existe um complexo multimérica com até 10 sítios de ligação de antígeno), uma vez estabelecida a ligaçãoo anticorpo-antígeno há a formação de grandes agregados reticulados. Como não há proprocionalidade conhecidada entre as concentrações de antígeno e anticorpos a serem adicionados, experimentalmente é necessário que pra uma mesma quatidade de antígeno, tenha-se uma diversidade de teste com diferntes concentrações de anticorpos para que obtenha-se o ponto de equivalência.

Comparando-se nossos resultados com os de outros grupos, pode-se percerber que a precipitação apenas dois grupos, nestes foi observado a fina linha brnca entre poços de antígeno e anticorpo. Na maioria dos grupos no entanto, assim como nós, não ocorreu a formação de precipitado. Tiveram grupos, que assim como nós, obteveram resultados na microprecipitação, mas não na imunodifusão. No geral os resultados forma inconstantes de grupo para grupo, não podendo fazer uma relação entre estes.

  • Microprecipitação:

No capilar onde ocorreu a turvação pode-se dizer que houve uma leve microprecipitação, neste capilar havia ovalbumina 1mg/mL e soro concentrado, no caso ocorreu a microprecipitação pois o antígeno é uma molécula solúvel, quando estes são partículas, o fenômeno é chamado de aglutinação. Acredita-se que isso ocorreu pois havia presente no soro sanguíneo anticorpos específicos para a proteína ovalbumina, o que era esperado já que o soro foi colhido de camundongos anteriormente imunizados utilizando-se como imunógeno essa proteína. Os camundongos foram submetidos à inoculação dorsal de cerca de 10mL de proteína ovalbumina de concentração 1mg/mL uma vez por semana durante três semanas. Os capilares onde não foi observada a microprecipitação provavelmente continham sim anticorpos específicos para a proteína ovalbumina, no entanto não em concentração suficiente para a formação de imunocomplexos.

O outro grupo que utilizou ovalbumina 1mg/mL nas imunizações, e inoculou o antígeno pelo peritônio, não observou microprecipitação. É possível pensar neste caso que possa ter havido um falso negativo pois talvez tenha havido microprecipitação só que não o suficiente para uma fácil visualização a olho nu, e assim o grupo pode ter considerado o resultado negativo para precipitação. Os grupos que utilizaram o soro sanguíneo de camundongos imunizados com ovalbumina 10mg/mL, tanto os que tiveram o peritônio como via de inoculação como os que tiveram o dorso, observaram microprecipitação nos capilares que continham soro concentrado e ovalbumina 1mg/mL e soro concentrado e ovalbumina 10mg/mL. Possivelmente por terem utilizado uma maior concentração de ovalbumina nas imunizações a resposta imunológica do camundongo foi maior resultando numa maior concentração de anticorpos específicos para o antígeno no soro do animal gerando assim uma maior ocorrência de microprecipitação. Os grupos que utilizaram o soro proveniente de camundongos imunizados com ovalbumina 0,1 mg/mL não observaram microprecipitação. Isso pode ser devido à baixa concentração de ovalbumina utilizada nas imunizações que resultou numa menor concentração de anticorpos específicos para a ovalbumina no soro e numa menor probabilidade de formação de imunocomplexo.

  • Tipagem Sanguínea:

O que caracteriza o tipo sanguíneo de um indivíduo pelo sistema ABO é a presença dos antígenos A e/ou B na membrana de seus eritrócitos. Para verificar quais antígenos estavam presentes na amostra de sangue do voluntário, realizou-se a hemaglutinação, isto é, utilizando anticorpos específicos para tais antígenos, observou-se a capacidade que eles tinham de interagir com eles e provocar aglutinação.

Ao adicionar-se à gota de sangue o anticorpo (ou aglutinina) Anti-B, verificou-se a aglutinação. Isto ocorreu, porque os aglutinogênios do tipo B encontravam-se em grande número nos eritrócitos do voluntário, de modo que uma mesma aglutinina se ligava simultaneamente a aglutinogênios de células diferentes, já que cada molécula de imunoglobulina possui pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno.

Como nada foi verficado na adição do anticorpo Anti-A, ficou indicado que não havia aglutinogênios do tipo A na membrana plasmática dos eritrócitos presentes na amostra. Deste modo, concluiu-se que o sangue do voluntário era do tipo B.

Para verificação do fator Rh, observou-se a presença do antígeno D na superfície dos eritrócitos através da adição do anticorpo Anti-D. A reação de aglutinação observada ocorreu da mesma maneira citada anteriormente, de modo a caracterizar o sangue do voluntário como Rh positivo.

Este teste é bastante utilizado para a determinação do fator Rh. Porém, existem casos onde os eritrócitos apresentam fraca expressão do antígeno D, são os chamados D “fracos”. Nestes casos, o resultado obtido é um falso negativo, tornando este método desaconselhável. O aconselhável seria a investigação dos antígenos Rh fracos pela prova de Coombs ou pelo método de gel-centrifugação, por exemplo.

Como o teste realizado apresentou claramente um resultado positivo, não seria necessária a investigação dos antígenos Rh fracos.

  1. Conclusão

Embora o processo de imunodifusão radial dupla seja mais sensível que o de microprecipitação, no primeiro não foi possível observar a linha de precipitação que esperava-se, enquanto que na microprecipitação foi possível em um dos tubos um resultado satisfatório.

Mesmo que não esperados tenham sido esses resultados foi possível a dissertação a respeito das possibilidades que poderiam tê-lo causado, tomando assim essas como objetivo do relatório acima explicitado.

Temos ainda o aprofundamento em técnicas importantes para um imunodiagnóstico, com o aprendizado prático da metodologia utilizada de forma a evitar o erro, e tirar as devidas conclusões teóricas dos resultados aparentes.

Muito embora os dois ensaios apresentados acima pudessem ter resultados mais satisfatórios, podemos observar no último ensaio uma semelhança com o que se esperava em volta do embasamento teórico ao qual é fundamentado, tendo-se então realizado corretamente as técnicas propostas, e cumprindo um dos objetivos da prática.

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