Coloração de bactérias- Estudo da forma e organização das bactérias. 1- Coloração simples com corantes básicos.

A coloração de células mortas é preferível às preparações a fresco, pois os corantes reagem quimicamente com as células bacterianas, e não interferem com o meio circundante, permitindo identificar estruturas internas e tirar maior partido da objectiva de imersão..

As colorações simples são aquelas em que se usa apenas um corante. A maioria dos corantes são sais, compostos por um anião e um catião.

O azul de metileno é um sal designado de cloreto de azul de metileno, que se dissocia do seguinte modo:

CAM (cloreto de azul de metileno) —> azul de metileno + + cloreto- A côr azul é dada pelo catião.

As bactérias possuem uma pequena carga eléctrica negativa, quando o pH do meio é aproximadamente neutro.

Assim, as células bacterianas combinam-se com o catião azul de metileno, obtendo-se a coloração azul das células.

São muito usados outros corantes, como o violeta de cristal e a carbol-fucsina.

Estes corantes diferem na sua taxa e grau de coloração.O azul de metileno reage com as células bacterianas à taxa mais lenta, de 30-60 segundos, o violeta de cristal é mais reactivo, usualmente requer só 10 segundos, a carbol-fucsina é um corante ainda mais rápido e actua em apenas 5 segundos.

Antes da coloração tem de se fazer um esfregaço, e fixá-lo pelo calor. Um esfregaço faz-se espalhando uma suspensão de bactérias numa lâmina limpa e deixando-a secar ao ar. O esfregaço é então levado à chama de um bico de bunsen, para fixar as bactérias pelo calor. Este passo desnatura as enzimas bacterianas, evitando que digiram partes das células, provocando a sua autólise. O calor também promove a aderência das células à lâmina.

2- Técnicas de coloração diferencial 2.1- Coloração de Gram

Os microrganismos diferem química e físicamente entre si, reagindo de modo diferente às operações de coloração. Este é o princípio básico da coloração diferencial. Então, designa-se coloração diferencial o método que permite destinguir tipos de bactérias. A coloração de Gram é muito utilizada em bacteriologia permitindo a distinção entre bactérias gram positivas e gram negativas. A diferença entre os 2 tipos de células relacciona-se com a estrutura da parede celular das bactérias. Assim a parede celular de bactérias ditas gram (+) é formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a parede celular de bactérias gram (-) é formada por uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarideo e proteina.

Diferenças na permeabilidade destas membranas aos reagentes quimicos, levam a diferenças de coloração. Na técnica de Gram utiliza-se primeiro um corante básico, o violeta de cristal, seguido de um mordente, o iodo de Gram que aumenta a afinidade da célula para o corante, um agente descolorante, o alcool a 95% que remove o corante, e finalmente um segundo corante básico por exemplo a safranina. As células que retêm o primeiro corante chamam-se gram (+) e as que descoram ficarão coradas pelo segundo corante e são as gram (-). Nas gram (-) o solvente alcool ou acetona remove a membrana externa da parede destas bactérias, e como a camada de mucocomplexo é pouco espessa não consegue reter o corante violeta de cristal que é assim retirado da célula por lavagem.

2.2- Coloração Ácido-Resistente

A coloração ácido-resistente foi desenvolvida por Paul Ehrlich (1882) para a bactéria Mycobacterium tuberculosis. A maioria das bactérias são descoradas pelo alcool-ácido e as bactérias das familias Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e Actinomycetales são acido-resistentes (acid-fast).

A coloração ácido-resistente é também uma coloração diferencial que mede a resistência das células coradas à descolorização por ácidos. Esta propriedade está relaccionada com o conteúdo lipidico das células. As paredes celulares dos microorganismos ácido-resistentes contêm ácido micólico que torna a parede celular impermeável à maioria dos corantes.

Neste tipo de coloração as células são coradas com carbol-fucsina quente, descoradas com solução de alccol-ácido, e coradas com um segundo corante como exemplo o azul de metileno. As bactérias ácido resistentes retem a coloração do primeiro corante.

3- Colorações estruturais

Algumas bactérias dos géneros Bacillus, Clostridium produzem endosporos, estruturas resistentes que sobrevivem em condições ambientais adversas. Utilizando-se o verde malaquite, obtem-se a coloração do endosporo, coloração essa que resiste à lavagem. Assim uma vez o endosporo corado, fica com a cor verde e o resto da célula que descorou por lavagem pode ser corado com um segundo corante como safranina (vermelho).

Outras bactérias possuem cápsulas externamente as quais coram mais fracamente do que a célula bacteriana. Estas cápsulas podem ser evidenciadas por coloração com vermelho do Congo.

Material e Métodos

1- Preparação e fixação de esfregaços de bactérias da sua cavidade bucal e de culturas que lhe serão fornecidas na aula:

a) Com uma espátula ou cotonete passe na lingua e dissolva o conteúdo numa pequena gota de soro fisiológico numa lâmina de microscopia.

b) Com uma ansa de metal préviamente esterilizada à chama do Bunsen, arrefecida por uns segundos, passe nas colónias em crescimento na placa de meio de cultura e dissolva o inóculo numa gota de água na lâmina de microscopia. Esterilize a ansa novamente à chama do Bunsen e coloque-a no suporte. Atenção: conserve a placa de meio de cultura fechada, apenas abra a tampa um pouco para retirar o inóculo. Desinfecte a ansa antes e depois de tocar nas colónias.

c) Após espalhar bem o inóculo na lâmina, deixe secar ao ar conforme demonstra a figura em anexo.

d)Passe rápidamente pela chama do Bunsen e) Proceda então à coloração de Gram. 2- Coloração de Gram: (de acordo com Hucker em Collins et al. 1999) a)Core com violeta de cristal por 60 segundos, b) Lave com esguicho de àgua corrente c) Cubra com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos d) Lave com esguicho de água corrente e) Descore com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos f) Lave com esguicho de àgua corrente g) Core com safranina, (ou vermelho neutro) 60 segundos h) Lave com àgua, seque e observe ao microscópio. Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de vermelho

3- Coloração Àcido - Resistente a) Ferva num goblet um pouco de água e coloque a lâmina com o esfregaço em cima recebendo os vapores de água.

b) Core com carbol-fucsina por 10 minutos, sem deixar secar a preparação (com aquecimento).

c) Lave com água corrente d) Descore com alcool-ácido, 95% de alcool étilico com 2.5% de ácido nitrico (HNO3) e) Lave com água corrente f) Core com azul de metileno, 30 segundos (sem aquecimento) g) Lave com água e seque.

Resultados: bactérias ácido - resistentes coram de vermelho, as outras de azul. Resultados e Discussão

Registe todas as suas observações, relativas à forma, organização e tamanho dos microrganismos observados. Apresente o relatório de acordo com as normas indicadas no programa da disciplina.

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