Baixe Apostila de aulas Praticas de BIOQUIMICA e outras Notas de aula em PDF para Medicina, somente na Docsity! uff UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR GCM ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS 1 PRÁTICA No 1 – TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E ESTUDO DO EFEITO-TAMPÃO 1. Introdução 1.1. Aminoácidos – estrutura e propriedades Em química, um aminoácido é qualquer molécula que contém simultaneamente grupos funcionais amina e ácido carboxílico. Em bioquímica, este termo é usado como termo curto e geral para se referir aos aminoácidos alfa: aqueles em que as funções amino (NH3 +) e carboxila (COO-) estão ligadas ao mesmo carbono, conforme a fórmula indicada na Figura 1: Figura 1 – Fórmula geral dos aminoácidos Como se pode observar, ambos os grupos estão ligados ao carbono central, ao qual está também ligado um grupamento lateral variável, denominado R. A estrutura dos aminoácidos dá origem a dois isômeros opticamente ativos, isto é, capazes de promover a rotação do plano da luz polarizada (Figura 2). Figura 2 – Isomeria dos aminoácidos Esses isômeros são denominados enantiômeros, são quirais (do grego kiros, que significa “mão”). São imagens especulares que não podem ser sobrepostas. A designação L ou D foi proposta por Emil Fischer, em 1891, com base na caracterização das formas L e D do gliceraldeído, conforme mostrado na Figura 3: Figura 3 – Relação entre as formas L e D do Gliceraldeído e da Alanina. Historicamente, as designações L e D foram usadas como abreviações dos adjetivos levorrotatório (provoca a rotação da luz para a esquerda) e dextrorrotatório (provoca a rotação da luz para a direita), respectivamente. Entretanto, sabe-se que nem todos os L-aminoácidos são levorrotatórios. Todos os aminoácidos das proteínas naturais têm a configuração L, porque as proteínas são sintetizadas por enzimas que reconhecem e inserem apenas L-aminoácidos nas cadeias peptídicas. Apenas alguns poucos peptídeos de HO O O- NH3+R RH3N+ OO- OH Espelho Imagem (D-aminoácido) Imagem refletida (L-aminoácido) NH3+ COO- HHO CH2OH CHO CHO HOH CH3 H H CH3 COO- H3N+ CH2OH L-Gliceraldeído D-Gliceraldeído L-Alanina D-Alanina NH3+ COO -R C H + 4 M de HCl é praticamente 1,0 (pH = -log [0,1]), enquanto o pH de uma solução 0,1 N de NaOH é praticamente 13,0 (pOH = -log [0,1] e pH = 14 - 1). O pH dos fluidos biológicos mantém-se mais ou menos constantes em valores próximos de 7,0 devido à presença de um grande número de substâncias capazes de captar ou liberar prótons. Nas células e nos fluidos biológicos predominam ácidos e bases fracos, que não são completamente ionizáveis em solução (alguns dissociam-se menos que 1 %). Sendo assim, a relação entre pH e o grau de dissociação de um ácido fraco não é direta como nos ácidos fortes. No entanto, ela pode ser analisada através da equação de Henderson-Hasselbach. Considere a reação de dissociação de um ácido fraco em solução aquosa: HA ↔ H+ + A- Aplicando a lei de ação de massas temos: Onde Ka é a constante de equilíbrio da reação. Rearranjando a equação temos: Logo: Chegamos finalmente à equação de Henderson- Hasselbach: A equação mostra que o pH de qualquer solução aquosa que contenha uma quantidade significativa de um ácido fraco dependerá da proporção (E NÃO DA QUANTIDADE ABSOLUTA) das formas dissociadas e não dissociadas do ácido e do pKa deste mesmo ácido. Se H+ ou OH- forem adicionados a uma solução contendo uma proporção adequada destas formas, a razão [base]/[ácido] será alterada ao consumir esses [H+] ou [OH-], sem variar o pH do meio e, é claro, mantendo-se inalterada a constante de dissociação, Ka Assim, o TAMPONAMENTO DE UMA SOLUÇÃO é a capacidade desta em resistir a variações de pH. Substâncias cuja presença na solução são responsáveis por este efeito são conhecidas como TAMPÕES. O fenômeno do tamponamento é um dos fatores que possibilitou o surgimento da vida. Em organismos vivos o pH dos diferentes ambientes é mantido estável, mesmo após a “adição” de ácidos ou bases. Em laboratórios pode-se preparar uma solução tampão utilizando-se uma base fraca ou um ácido fraco (ex.: ácido acético) e sua base conjugada na forma de um sal (ex.: acetato de sódio). Em pesquisa científica os tampões são essenciais para a manutenção do pH em uma grande variedade de procedimentos, por exemplo, cultura de células e tecidos, medida de atividade enzimática, purificação de proteínas, etc... Normalmente utiliza-se um tampão para manutenção de um valor de pH que se encontre uma unidade acima ou abaixo de seu valor de pK, pois dentro desta faixa o seu efeito tamponante é muito mais eficiente (como exemplo, verifique as inflexões da curva de titulação dos aminoácidos nesta aula prática). 2. Objetivos • Determinar os valores de pK das soluções de aminoácidos (Glicina e Ácido glutâmico) através de titulação; • Construir as curvas de titulação para cada um dos aminoácidos; • Manusear e compreender o funcionamento de um medidor de pH. Ka = [H+] [A-] [HA] 1 = 1 x [A-] [H+] Ka [HA] log 1 = log 1 + log [A-] [H+] Ka [HA] pH = pKa + log [A-] [HA] 5 • Estudar o efeito tamponante de misturas contendo proporções e concentrações diferentes de um ácido fraco e sua base conjugada. 3. Reagentes Soluções de Glicina e ácido Glutâmico 0,02 M (pH 1); Solução de NaOH 0,5 N. Solução de HCl 1 M. Soluções-padrão para calibração do medidor de pH. Solução de ácido acético 0,2 M Solução de acetato de sódio 0,2 M. 4. Procedimentos 4.1. Procedimentos gerais de ajuste do medidor de pH • Ligar o aparelho; • Retirar o eletrodo do recipiente contendo solução de KCl 3M e lavá-lo com água destilada. • Imergir o eletrodo na solução-padrão de pH 7 e calibrar o aparelho no botão adequado. • Retirar o eletrodo da solução e repetir o procedimento de ajuste, agora para a solução-padrão de pH 4,0, no botão adequado. • Lembrar de sempre colocar o aparelho em “stand by” quando eletrodo não estiver imerso em uma solução. 4.2. Procedimentos para titulação dos aminoácidos • Em um bécher colocar 40 mL de glicina ou ácido glutâmico. • Mergulhar uma barra magnética na solução e posicionar o bécher sobre a placa agitadora. • Inserir o eletrodo limpo e calibrado na solução, de modo que a junção cerâmica fique submersa (cuidado para o bulbo não esbarrar na barra magnética). • Sob agitação, titular com NaOH 0,5 N, adicionando 0,2 mL por vez e anotando o pH após cada adição (adicionar o NaOH diretamente à solução, sem esbarrar no eletrodo ou na parede interna do bécher). • Construir o gráfico de pH da solução versus volume de NaOH adicionado. 4.3. Procedimentos para estudo da capacidade tamponante • Em quatro bécheres, adicionar os volumes indicados das soluções de ácido acético, acetato de sódio e água: Bécher Ácido acético Acetato de sódio H2O 1 20 mL 20 mL -- 2 10 mL 10 mL 20 mL 3 25 mL 15 mL -- 4 15 mL 25 mL -- • Repetir os procedimentos descritos acima para titulação de cada uma das soluções, mas desta vez adicionar 5 x 0,5 mL de NaOH 0,5 N. Anotar o valor de pH a cada adição. • Construir o gráfico de pH das soluções versus volume de NaOH adicionado. 5. Questões para discussão 1) Em relação à prática realizada: a) Quais os valores de pK e pI da glicina e do ácido glutâmico? b) Por que a curva de titulação do ácido glutâmico é diferente da curva da glicina? c) Calcule o pH teórico das soluções 1, 2, 3 e 4, sabendo que o Ka do ácido acético é 1,74 × 10-5. 6 2) Você pode utilizar um aminoácido para fazer uma solução-tampão? Por quê? 3) Como a concentração de um tampão afeta a sua capacidade tamponante? 4) Um tampão mantém constante o pH de um meio indefinidamente? 5) Calcule o grau de dissociação inicial do ácido acético 0,2 M. (Dica: considerando que a [H+] é igual à concentração de íons acetato, podemos reescrever a reação de dissociação da seguinte forma: 0,2 – y = y × y. Sendo assim a expressão de equilíbrio pode ser: o que gera uma equação do segundo grau que pode ser resolvida!). 6) Quais serão as concentrações de ácido acético e acetato de sódio necessárias para fazer um tampão de pH 5,1 com a soma ácido acético + acetato = 0,2 M? 7) Num laboratório hospitalar uma amostra de 10 mL de suco gástrico, obtida várias horas após uma refeição, foi titulada com NaOH 0,1N até neutralidade; foram necessários 7,3 mL. Como o estômago não continha nem alimento nem bebida, pode-se assumir que não havia tampões presentes. Qual o pH do suco gástrico? Ka = y2 0,2 - y 9 substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem sem pre são obedecidas. Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções, etc. Também as presenças de ácidos, bases e sais na solução podem contribuir para essas desobediências, por estarem mais completamente dissociados, à medida que aumenta a diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada pelas moléculas não ionizadas. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve- se trabalhar com soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as absorvâncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado. Desta forma, teremos os limites de concentração nos quais a solução obedece às Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o emprego da curva padrão, podemos, também, determinar a concentração de uma solução problema. O comprimento de onda (λ) usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de absorção da substância em estudo e é, normalmente, o λ onde a absorvância para a substância apresenta o valor máximo. 2. Objetivos • Determinar o espectro de absorção de uma solução de Azul de Bromofenol em pH neutro e em pH ácido; • Caracterizar o comprimento de onda (λ) onde ocorre absorção máxima; • Construir uma curva padrão do Azul de Bromofenol. 3. Reagentes • Solução de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em meio levemente ácido (amarelo) e Solução de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL (azul/violeta). 4. Procedimentos 4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotômetro • Ligar o aparelho; • Selecionar o comprimento de onda adequado. • Ajustar o zero de transmitância; • Introduzir a cubeta com o branco (água destilada) e ajustar a 100% de transmitância, no botão correspondente; • Repetir os ajustes acima. • Obtenção do espectro de absorção: • Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 400 nm; • Ajustar o 100% de transmitância com o branco. Isto coincide com o 0 de absovância; • Colocar a cubeta com a solução de Azul de Bromofenol em meio ácido à concentração de 1 mg/100 mL; • Ler a absorvância e registrá-la; • Ajustar o λ a 430 nm, repetir o ajuste do branco, recolocar a solução de Azul de Bromofenol e ler, novamente, a absorvância correspondente a este λ; • Repetir estas operações para os seguintes valores de λ: 450, 470 e 490; • O mesmo será feito para o Azul de Bromofenol em pH neutro. Sendo os comprimentos de onda analisados, respectivamente: 500, 530, 550, 570 e 590. • Fazer o gráfico dos espectros de absorção do Azul de Bromofenol em papel milimetrado, relacionando absorvância (ordenada) contra λ (abcissa); • Determinar o λ de absorvancia máxima. 10 Azul de Bromofenol (pH<3) Azul de Bromofenol (pH>4,6) λ A A 410 430 450 470 490 510 530 550 570 590 Dados: 1) Espectofotômetro: TUNER, modelo 330 2) Solução: Azul de bromofenol em meio ácido (1mg/100ml) e Azul de bromofenol em pH neutro (1mg/100ml). 3) λ: comprimento de onda. 4) A: absorvância. 4.2. Curva padrão – Obtenção 1) Fazer diluição seriada: • Utilizar 6 tubos de ensaio e enumerá-los. • Adicionar 4ml de H2O em cada tubo. • Colocar 4ml de Azul de Bromofenol no tubo 1e agitar. • Retirar 4ml da solução do tubo 1 e adicionar no tubo 2. Repetir em todos os tubos. • No tubo 6 retirar 4ml e descartar. • Cada tubo estará, desta forma, diluído em 2x com relação ao anterior. 2) Preparar soluções de Azul de bromofenol nas concentrações citadas na tabela abaixo: Concentração de Azul de Bromofenol (mg/100ml) Absorvância (pH<3) Absorvância (pH>4,6) 0,50 (1/2) 0,25 (1/4) 0,125 (1/8) 0,0625 (1/16) 0,03125 (1/32) 0,015625 (1/64) • Ler as absorvâncias das diferentes soluções de Azul de Bromofenol (no λ ideal) e registrá-las; • Construir, em papel milimetrado, a curva padrão (absorvâncias na ordenada e concentrações na abscissa), considerando os pontos zero de absorção e de concentração. 5. Questões para discussão 5.1- Explique porque o Azul de Bromofenol apresenta colorações diferentes com a mudança no pH da solução. 5.2- Você dispõe dos filtros azul, verde, vermelho e amarelo de um fotômetro. Qual deles você usará, para que uma solução de cor vermelha tenha uma absorção (contra o branco) o mais próximo de zero possível? 5.3- Avalie, nas condições experimentais acima, se o Azul de Bromofenol segue, estritamente, as Leis de Lambert- Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento. 5.4- Explique por que não se deve usar cubetas de vidro para leituras na região do ultravioleta. 6. Questões complementares 6.1 – Você pesou l, 2 e 3 mg de Azul de Bromofenol e dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovâncias destas soluções, em 430nm, foram, respectivamente, 0,2, 0,4 e 0,6. A abosvância de uma solução desconhecida do sal foi 0,3. Calcule a sua concentração, em mg/100mL. 6.2 – Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente, a amostra foi diluída em 10 vezes (no processo de desproteinização). 1mL do desproteinizado e 2mL de cada 11 um dos padrões de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100mL foram processados para a dosagem da glicose, sendo o volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. Após as leituras espectrofotométricas em comprimento de onda adequado, as absorvâncias obtidas foram: Amostra...................... ...0,180 P-10 mg/100mL............. 0,150 P-20 mg/100mL..............0,298 P-30 mg/100mL..............0,400. Qual a concentração da glicose no sangue do paciente? 6.3 - O coeficiente de extinção molar (ε) de uma substância de peso molecular 200 é 14,5. Uma solução desta substância apresentou , numa cubeta de caminho óptico de 2 cm, a absorvância de 0,800. Qual a concentração (em mg/L) da substância nesta solução? • Papel milimetrado: 14 • Tubo 7 (tubo de centrífuga): colocar 1 mL de TCA 10% (P/V). + 1 mL da solução diluída de proteínas; • Agitar e observar; • Centrifugar (por 10 minutos), separando as frações sobrenadante e precipitado; • Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8; • Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8; • Adicionar tampão ao precipitado do Tubo 7. Agitar; • Comparar os resultados. 4.5. Efeito da adição de sais: • Tubo 9: Colocar 2 mL da solução diluída de proteínas + 2 mL da solução saturada de sulfato de amônio. Agitar. Centrifugar à 3000rpm por 10 minutos, separar as frações sobrenadante e precipitado; • Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar dissolvê-lo com 1 mL de tampão; • Adicionar 1 mL de tampão ao precipitado do tubo 10 e agitar. Verificar o que acontece. 4.6. Efeito da adição de solventes orgânicos: • Tubo 11: colocar 1mL da solução de proteínas + 2mL de etanol gelado (lentamente até o aparecimento de uma ligeira turvação). 4.7. Cromatografia em peneira molecular: Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30 x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampão pH 7,0, deixando a extremidade inferior da coluna aberta, até que o gel se acame. Cuidado para não deixar secar o gel, adicionando sempre tampão, até que o gel esteja equilibrado e acamado. Aplicação da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a superfície da coluna, que deverá estar com cerca de 2 cm de tampão sobre o gel. Como a amostra está mais densa, devido à presença da sacarose, esta se depositará sobre o gel. Continuar adicionando o tampão e acompanhar o fracionamento dos componentes da amostra, anotando os resultados. 5. Questões para discussão: 5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada. 5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos afirmar que a solução de sulfato de amônio saturado precipita todas as proteínas? Por quê? Como podemos saber se esta precipitação é reversível ou não? 5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos afirmar que o etanol gelado precipita todas as proteínas? Por quê? Como poderíamos comprovar isto? O precipitado obtido (após centrifugação) seria redissolvido em tampão? Por quê? 5.4 - Qual foi a ordem de eluição das amostras na coluna (item 4.7)? Por quê? 6 - Exercícios complementares: 6.1- Você dispõe num laboratório de dois frascos idênticos, porém, não rotulados. Um deles contém solução de aminoácidos e, o outro, contém uma solução de proteínas. Qual seria o seu procedimento para identificar as duas soluções e rotular os frascos? 6.2- Descrever um método que permita separar a proteína no 6 de uma mistura que contenha seis proteínas, sabendo-se que: a) as proteínas de no 1, 3 e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a 40% de saturação; b) as proteínas de no 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol gelado; c) as proteínas de no 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a 75% de saturação; d) os pontos isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6,5 ; o da proteína 2 é 7,2; o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6,3 e o da proteína 5 é 6,8. 15 6.3- Num extrato biológico existem hormônios protéicos e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais pura possível para uso posterior. Você dispõe de sulfato de amônio, TCA, etanol, resinas cromatográficas, equipamentos cromatográficos e de eletroforese. Que métodos você poderia utilizar? Explique o seu princípio e como executá-lo. Que métodos não poderiam ser utilizados? 6.4- Uma solução a 1% de hormônio anti-diurético (nonapeptídio) foi submetida aos tratamentos abaixo com os seguintes resultados: a) reação fortemente positiva para o biureto e fracamente positiva para ninhidrina; b) a adição de ácido forte gelado e posterior neutralização do pH, não alteraram os resultados do item anterior; c) Com a adição de ácido forte à quente (100oC por 2 h) e posterior resfriamento e neutralização do pH , a reação da ninhidrina foi positiva (fortemente positiva). Interprete e explique estes resultados. 16 PRÁTICA No 4 - CINÉTICA ENZIMÁTICA 1. Introdução Enzimas são catalisadores biológicos: aceleram a velocidade das reações químicas, diminuindo a energia de ativação. Possuem, em geral, estrutura protéica, sendo que foram descritas algumas moléculas de RNA com atividade catalítica. As enzimas não alteram a constante de equilíbrio nem a variação de energia livre das reações, sendo regeneradas, sob a forma original, ao final da catálise. As moléculas reagentes são denominadas substratos (S) e produtos (P) são formados ao final. As enzimas são, geralmente, bastante específicas com relação aos substratos, formando um complexo com estes durante a catálise: E + S ↔ ES ↔ E + P Algumas teorias procuram explicar esta especificidade: 1- teoria de Fischer (“chave-fechadura”) , onde enzima e substrato seriam complementares; 2- teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o substrato durante a catálise se encaixa na enzima; 3- teoria que propõe o perfeito encaixe no estado de transição, estado onde a barreira energética (energia de ativação) foi vencida. Diversos são os fatores que influenciam a velocidade de uma reação enzimática. Por terem estrutura protéica, alterações no pH, na temperatura, na força iônica do meio reacional podem modificá-las (ás vezes, até a estrutura dos substratos é alterada), modificando, assim, a velocidade das reações. Como esperado, a concentração de substrato e de enzima no meio reacional são determinantes para a velocidade reacional. A velocidade de uma reação catalisada pode ser determinada, em instantes iniciais, através da determinação do produto formado por unidade de tempo (caso mais comum) ou através da mensuração do substrato consumido por unidade de tempo. O produto formado pode ser medido diretamente através de alguma propriedade físico-química característica, ou então fazer uma reação química com este produto produzindo um outro que possua propriedades apropriadas para medida. Uma propriedade freqüentemente usada para tal fim é a capacidade do produto a ser quantificado de absorver determinados comprimentos de onda de radiações luminosas (o que não deve, em princípio, acontecer com qualquer outra substância encontrada no meio reacional), aplicando-se os princípios da fotometria. Os ensaios de atividade enzimática desenvolvidos na aula prática serão realizados com a enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisará a reação de desfosforilação do para-nitrofenil fosfato, resultando na formação de um composto de cor amarelada em meio alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade enzimática será detectada pelo aparecimento da coloração amarela no meio reacional. 2. Objetivos Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimática, tais como, o tempo de reação, a concentração de substrato e a concentração de enzima. 19 PRÁTICA No 5 – URINÁLISE 1. Introdução Os rins desempenham suas funções mais importantes ao filtrarem o plasma sangüíneo e removerem as substâncias do filtrado em quantidades variáveis, dependendo das necessidades do corpo. Além disso, eles “depuram” as substâncias indesejáveis do filtrado (e, portanto, do sangue), ao excretá-las na urina, enquanto devolvem ao sangue as substâncias indispensáveis ao metabolismo. A intensidade de excreção de diferentes substâncias na urina representa a soma de três processos renais: filtração glomerular, reabsorção de substâncias dos túbulos renais para o sangue e secreção de substâncias do sangue para os túbulos renais. A urina normal é essencialmente composta de água, tem coloração variável entre o incolor e o amarelo (dependente da dieta, atividades físicas e principalmente da ingestão de água), e carreia substâncias de excreção, resultantes do metabolismo do organismo. Todo sangue, ao passar pelos rins, é filtrado ou depurado, eliminando seus catabólitos, que são veiculados pela água. Entretanto, podem aparecer na urina elementos anormais, como: albumina, glicose e altas quantidades de corpos cetônicos, sais e pigmentos biliares (urobilinogênio e urobilina). A análise da urina fornece valiosas informações no diagnóstico de doenças renais, das vias urinárias, do trato genital e até de doenças sistêmicas. Esta prática refere-se a dois dos exames de rotina de urina, através dos quais é possível observar o metabolismo anormal envolvendo algumas substâncias como a glicose e os corpos cetônicos. Em condições normais, não aparece glicose na urina em quantidade detectável pelos reagentes convencionais, visto que, praticamente, toda a glicose filtrada é reabsorvida pelos rins. Entretanto, quando a carga filtrada excede a capacidade de reabsorção da glicose, a sua excreção urinária se dá em nível detectável. Um grande aumento da concentração plasmática de glicose, capaz de elevar a carga de filtração renal acima de 320 mg/minuto, ocasiona a excreção do excesso de glicose na urina. A glicose plasmática no indivíduo sadio quase nunca fica elevada o suficiente para causar a sua excreção pela urina. A glicosúria (presença de glicose na urina) pode estar relacionada a várias causas, como, por exemplo: fatores endócrinos, hepáticos, neurológicos e alimentares. No diabetes mellitus não-controlado, o nível plasmático de glicose pode atingir valores elevados, com conseqüente excreção urinária desta ose. A presença de glicose na urina pode ser evidenciada através da redução alcalina pelo cobre. Portanto, utiliza-se para a pesquisa de glicose na urina o reagente de Benedict, que consiste de uma solução de sulfato de cobre em um meio alcalino. Os chamados corpos cetônicos (acetoacetato, ácido β-hidroxibutírico e acetona), quando presentes em níveis elevados na urina, indicam um quadro de jejum severo e prolongado ou diabetes mellitus não tratado. Em condições normais, o ácido acetoacético e o ácido β-hidroxibutírico que entram na corrente sangüínea são transportados, tão rapidamente, para os tecidos, que suas concentrações plasmáticas, combinadas, raramente se elevam acima de 3 mg/dL. Os corpos cetônicos são liberados do fígado e transportados até as células. Todavia, as células são limitadas, quanto à quantidade de corpos cetônicos que podem oxidar, devido a várias razões, dentre as quais pode-se destacar a quantidade de oxaloacetato que é necessário para iniciar a oxidação de Acetil-CoA no ciclo do ácido cítrico. Os corpos cetônicos no sangue e na urina podem atingir níveis 20 extraordinariamente altos, provocando uma condição conhecida como: cetonemia e cetonúria, respectivamente. A pesquisa de corpos cetônicos na urina é realizada através do reagente de Imbert. Este reativo é de uma solução de nitroprussiato de sódio em ácido acético glacial. 2. Objetivo Analisar amostras de urina, quanto à presença ou ausência de glicose e de corpos cetônicos. 3. Reagentes • 8,5 mL de urina. • 2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO4; citrato de sódio e Na2CO3). • 1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sódio e ácido acético glacial). • 3 mL de NH4OH 10% (p/v). 4. Procedimentos 4.1. Pesquisa de Glicose • colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo de ensaio; • depositar 4 gotas de urina límpida; • misturar e levar ao banho-maria até entrar em ebulição; • deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente 15 minutos); • observar a coloração do líquido. RESULTADOS cor inalterada (azul) negativo verde-azulado ou verde traços verde (qualquer tom) com precipitado amarelo positivo + castanho ou marrom positivo ++ vermelho tijolo positivo +++ 4.2. Pesquisa de Corpos Cetônicos • colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio; • adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar; • inclinar o tubo e com o auxílio de uma pipeta, deixar escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3 ml de NH4OH 10%, lentamente, de tal maneira que os dois líquidos não se misturem; • observar a superfície de contato entre os dois líquidos. 5- Questões para Discussão 5.1- Comente (sucintamente) a participação dos hormônios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulina no controle da glicemia, envolvendo as vias metabólicas e os seus mecanismos de ação. 5.2- Por que em condições de jejum severo e prolongado ou o diabete melito não compensado pode acarretar uma cetonemia e conseqüente cetonúria? 5.3- Conceitue e diferencie (metabolicamente): “diabetes insipidus” e “diabetes mellitus” e “diabetes renallis”. RESULTADOS Nenhuma alteração ocorrida negativo Presença de um anel violeta positivo 21 PRÁTICA No 6 - ISOLAMENTO DE DNA DE CÉLULAS DE CEBOLA 1. Introdução Nos organismos eucariontes e procariontes a informação genética está localizada nas moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA), que são polímeros de nucleotídeos, nos quais o açúcar é a desoxirribose. O DNA está localizado principalmente no núcleo dos eucariontes, associado com proteínas (principalmente histonas) e dentro de organelas como mitocôndrias e cloroplastos. Os métodos utilizados para a detecção e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o de cloroplastos e mitocôndrias não é em geral, detectado pelas técnicas rotineiras) implicam no rompimento das membranas citoplasmática e nuclear. Neste experimento, o rompimento das membranas plasmática e nuclear será realizado com o tratamento do detergente aniônico duodecil sulfato de sódio (SDS). Os tratamentos com detergentes, iônicos ou não, são largamente utilizados na solubilização de proteínas e lipídeos de membrana. Nestes processos de solubilização por detergentes, são formadas micelas, que consistem de proteínas, lipídios e detergentes. O tratamento das células com uma concentração relativamente alta de SDS resulta no rompimento das membranas celulares com a conseqüente liberação das nucleoproteínas. A atividade da enzima digestiva (DNAase) será inibida pela ação do EDTA em meio alcalino − que altera pH e quela os íons divalentes necessários à ação da DNAase. A adição de etanol sobre a fase aquosa, contendo os ácidos nucléicos dissolvidos, resultará na precipitação destes, uma vez que o etanol diminui a constante dielétrica da água, promovendo uma menor solubilização das moléculas de DNA. Nas técnicas de biologia molecular, o DNA deve estar livre de proteínas, para isto, estas devem ser extraídas. Normalmente, esse procedimento é realizado utilizando-se uma solução de clorofórmio/álcool isoamílico, que desnatura as proteínas e, após centrifugação, estas são retiradas da solução de DNA. 2. Objetivo Isolar DNA de células de cebola. 3. Material • Cebola. • Solução salina-EDTA: NaCl 0,15 M EDTA 0,1 M (pH=8,0). • SDS 2% (P/V). • Etanol absoluto 95%. • Solução Tris-EDTA (TE)* 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5. Obs: *Esta solução mantém a força iônica, dissolvendo o DNA, além de quelar íons divalentes, necessários para a ação da DNase. 4. Procedimentos • Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada); • Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15 mL; • Adicionar 2.5 mL de solução salina EDTA; • Adicionar 1.0 mL de SDS 2%; • Macerar a cebola com ajuda de um bastão de vidro durante 5 minutos; • Filtrar a solução com gaze para retirar os fragmentos de cebola; • Colocar o filtrado em um tubo de vidro; • Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de álcool etílico 95% de modo que os dois líquidos não se