5º semestre.part01 - inter exames lab02

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(Parte 2 de 4)

2.3.1 Exame Direto para a Pesquisa de Ovos de Helmintos (Kato & Miura, 1954):

É um método para contagem de ovos de helmintos. Coloca-se 60 a 70 mg de fezes (tamanho de um grão de feijão preto) em uma lâmina de microscopia. Em seguida devem-se cobrir as fezes com lamínula e celofane (embebida em solução aquosa de verde de malaquita a 3%), após a remoção do excesso do corante. Comprimir a lamínula, com uma folha de borracha macia, e espalhar o material com uniformidade até as margens da cobertura de celofane. Examinar ao microscópio.

46 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

2.4 Técnicas de Concentração:

2.4.1 Flutuação Simples:

Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio (Willis, 1921): Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g., coletada de várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do recipiente com solução saturada de cloreto de sódio. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não deverá haver formação de bolhas de ar entre a lamínula e a superfície do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento.

Observações: Os ovos não flutuam na superfície do reagente quando a homogeneização do material fecal é incompleta, havendo uma imperfeita separação dos ovos e dos detritos fecais. A flutuação é muito curta (menos de 30 minutos) ou muito longa (mais de 60 minutos). Nesse caso os ovos que flutuam na superfície podem descer para o fundo da pequena cuba (Suzuki, 1980).

2.4.2 Centrífugo-Flutuação:

Centrifugo - Flutuação em solução de Sulfato de Zinco (Faust et al. 1938):

2.4.2.1 Material fecal fresco:

Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 mL de água corrente . Filtrar a suspensão através de gazes dobrado em quatro vezes e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar (650 x g por 1 minuto). Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de água corrente ao sedimento, antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.

47 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Repetir até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 mL do reagente, e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g por 1 min). Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação colocá-lo em uma estante em posição vertical. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 m) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferindo várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos, larvas e cistos. Alguns pesquisadores preferem à sobreposição de uma lamínula na borda do tubo à remoção da película com alça de arame (Burrows, 1965: Melvin & Brooke, l982).

2.4.2.2 Material Fecal Preservado pela Solução de Formaldeido:

A suspensão fecal formolizada deverá ser aproximadamente uma parte de fezes para duas a três partes de solução de formoldeido. Se a suspensão for muito espessa, diluir com solução de formaldeido a 10 % para se aproximar da proporção. Filtrar a suspensão fecal formolizada, através de gazes umedecidas de modo a obter ¾ de um tubo de 13 x 100 m. Adicionar, se necessário, ao tubo água corrente. Seguir as demais etapas como foi descrito para o material fecal não preservado, usando sulfato de zinco de densidade 1.20 g/ml.

Observação: Alguns ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes na superfície da membrana, em densidade alta de 1,20 g/mL. Entretanto, para um exame completo, deverá ser examinada a membrana e o sedimento, uma permanecia prolongada da suspensão de fezes na solução de sulfato de zinco, de alta densidade específica, pode resultar em colapso e distorção dos cistos e dos ovos de nematóides com parede fina. Examinar a preparação após 20 minutos (Ash & Orihel, 1987).

2.4.3 Técnica de Sedimentação:

2.4.3.1 Sedimentação Espontânea em água (Lutz, 1919; Hoffmann, Pons e Janer, 1934):

48 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores

Baseado na sedimentação espontânea das fezes após duas horas. É um método específico para pesquisa de Schistosoma mansoni, porém por mostrar-se altamente eficiente também nas pesquisas de protozoários, este método é amplamente utilizado para a pesquisa dos demais parasitas. Tomar cerca de 4 g de fezes recém emitidas, após dissolver no próprio recipiente de coleta (frasco padrão para coleta de amostra) utilizando um pouco de água. Transferir o material dissolvido para um cálice de decantação fazendo filtrar em peneira contendo gaze dobrada em quatro. Completar até ¾ do volume de água e deixar repousar em superfície firme e livre de vibrações por no mínimo 2 horas. Retirar o sedimento com um canudo ou pipeta Pasteur e transferir para lâmina de vidro adicionando 2 gotas de solução de Lugol e cobrindo com lamínula. Observar ao microscópio em objetiva de 10x.

Observação: Melvin & Brooke, (1982) e Ash & Orihel (1987) apresentaram a seguinte conduta depois de concluída a suspensão em repouso: decantar com cuidado 2/3 do líquido sobrenadante sem perder nenhuma porção do sedimento; ressuspender o sedimento em água corrente, e deixar a suspensão em repouso por mais 1 h; esse procedimento de lavagem pode ser repetido até que o líquido sobrenadante fique relativamente claro. Após seguir as etapas como na técnica acima descrita.

2.4.3.2 Centrífugo-Sedimentação: Centrífugo - Sedimentação pela Formalina-Éter, (Ritchie, 1948):

Material Fecal a Fresco: Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10mL de água corrente ou solução salina a 0,85%; filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 mL. Centrifugar (650 x g por minuto); Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de água corrente ou solução salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendêlo. Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar (650 x g por 1 min). Repita a etapa até que o sobrenadante se apresente relativamente claro. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2 mL de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10% , pH neutro). Completar o volume da suspensão em 10 mL com formalina a 10%. Deixar em repouso durante 5 minutos. Adicionar 3mL de éter ou acetado de etila,

49 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado. Centrifugar (500 x g por 1 min). Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino, e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento, preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos.

2.5 Métodos Quantitativos:

2.5.1 Método Modificado de Kato-Katz (Kato, 1960; Katz, Chaves e Pellegrino, 1972):

Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe através das malhas. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando as fezes com a lamínula. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 minutos a 34-40°C ou à temperatura ambiente por 1-2 horas. Examinar a preparação ao microscópio

2.6 Métodos para Isolamentos de Larvas:

2.6.1 Método de Baermann (1917) e Moraes (1948):

Método baseado no hidrotermotropismo positivo das larvas de Strongyloides stercoralis. Colocar a água aquecida (aproximadamente 50 ºC) no funil com o tubo de látex vedado pela pinça de Mohr, quantidade suficiente para tocar a extremidade inferior da

50 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores peneira contendo as fezes. Depositar pequena quantidade de fezes sobre a peneira contendo gaze e deixar em repouso por 45 a 60 minutos. Após este tempo, soltar a pinça de Mohr e deixar que o material escorra para um tubo de hemólise. Centrifugar o material em baixa rotação e observar o sedimento em objetiva de 10x. Este método é específico para a pesquisa de larvas de S. stercoralis.

Nota: Esse método é baseado no hidro e termotropismo das larvas que saem do material, migrando para a água quente; por densidade, se depositam no fundo do funil. Para maior comunidade, costuma-se construir um pequeno suporte de tábua, com vários furos circulares para receberem os funis, facilitando o trabalho. Algumas vezes, para examinar larvas de helmintos há necessidade de matá-las e, para isso, é adicionado gotas de lugol (estando imóveis, permitem a visualização dos detalhes no diagnóstico específico).

2.6.2 Método de Rugai, Mattos & Brisola (1954):

Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás; Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a 40-45°C, um copo cônico de sedimentação (capacidade de 125ml); Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar; Deixar em repouso durante 60 minutos. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa. Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do líquido; Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de lugol. Observação: Este método é indicado para a pesquisa de larvas de S. Stercoralis.

2.7 Método de Graham (Teste da fita adesiva/gomada):

A fêmea do Enterobius vermicularis faz sua postura na região perianal durante a noite, e não no lúmen intestinal. Por isso, o exame de fezes de rotina é quase sempre ineficaz (negativo). Assim, deve ser utilizado o método de pesquisa na fita adesiva (método

51 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores de Graham, swab anal para a pesquisa de oxiúros). O material deverá ser coletado algum tempo após o paciente ter se deitado, ou pela manhã, ao acordar, antes de qualquer higiene.

Colocar um pedaço de fita adesiva transparente em uma espátula de madeira tipo abaixador de língua com a parte adesiva voltada para fora; Pressionar firmemente a espátula contendo a fita adesiva contra as pregas anais e perianais; Colar a fita adesiva em lâmina devidamente identificada, de maneira que fique bem distendida, lisa e sem bolhas de ar. No momento da execução do exame, levantar cuidadosamente a fita da lâmina e pingar uma gota de toluol ou xileno e pressionar novamente a fita contra a lâmina. A preparação ficará clara ou levemente corada, tornando os ovos bem visíveis. Caso o material não seja examinado imediatamente, não acrescentar o toluol.

Parasitas

Intestinais Hoffm ann Kato- Katz Biópsi retal

Baerman n- Moraes

Tami zaçã o

Identifica ção de vermesadultos adultos

Graham MIF Rugai- Matos-

Brisola

Ascaris lunbricoides E E Ñ P Ñ E Ñ E Ñ

Trichuris trichiura E E Ñ P Ñ E Ñ E Ñ Ancilostomídeos E P Ñ P Ñ E Ñ E Ñ

Schistosoma mansoni P E E Ñ Ñ E Ñ P Ñ Enterobios vermucularis P P Ñ P Ñ E E P Ñ

Strongyloides stercopalis P Ñ Ñ E Ñ E E P E Taenia sp. P P Ñ P E E Ñ P Ñ Girardia lablia E Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ

Entemoeba histolytica E Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ Entemoeba coli E Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ

Endolimax nana E Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ

Iodamoemba butschii E Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ Chilomastix mesE Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ E Ñ

52 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores nilli

E=EletivoP=Possível Ñ=não-indicado

Cryptosporidium parvum Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ P Ñ Isospora beli P P Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ PÑ Tabela contendo alguns parasitos intestinais e respectivas técnicas para identificação

3. Pesquisa de Elementos Anormais nas Fezes:

É pesquisada a presença de hemácias, leucócitos, pH, rotavírus, etc. Como os leucócitos e as hemácias são rapidamente destruídos no lúmen intestinal, quando presentes, sugerem a presença de lesões intestinais mais altas, associadas ao aumento do trânsito intestinal, ou de lesões de partes mais baixas do cólon, como colites ulcerativas, disenterias bacilares, diverticulite e tuberculose intestinal. A presença de leucócitos isolados sugere infecções bacterianas, colites inflamatórias e, quando em menor quantidade, pode estar associada a lesões parasitárias. As fezes frescas devem ser coletadas em frasco plástico. No caso de fezes sólidas ou pastosas, a quantidade deverá corresponder a 5 colheres plásticas fornecidas com o frasco de coleta. Se as fezes estiverem liquefeitas, pelo menos 10 mL deverão ser fornecidas ao laboratório para análise. As fezes deverão ser coletadas originalmente num recipiente limpo, e a seguir transferidas para o frasco coletor. O paciente não deve estar em uso de laxantes nem ter sido submetido ao uso de contrastes radiológicos nos três dias anteriores à coleta. Durante a coleta, é importante evitar a contaminação pela urina, pois a sua presença acelera a fermentação bacteriana, prejudicando a conservação.

A presença de gordura fecal é indicativa de má absorção de gorduras pelo intestino. É

3.1 Pesquisa de Gordura Fecal: importante como diagnóstico de triagem da esteatorréia associada a patologias do intestino delgado, fibrose cística de pâncreas, pancreatite crônica, doenças inflamatórias intestinais, enteropatias virais, bacterianas e parasitárias. Fezes frescas devem ser coletadas em frasco

53 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados a seus respectivos autores plástico. As instruções para coleta são as mesmas: No caso de fezes sólidas ou pastosas, a quantidade deverá corresponder a 5 colheres plásticas fornecidas com o frasco de coleta. Se as fezes estiverem liquefeitas, deverão ser fornecidos ao laboratório pelo menos 10 mL para análise. As fezes deverão ser coletadas originalmente num recipiente limpo e a seguir transferidas para o frasco coletor. O paciente não deve estar em uso de laxantes nem ter sido submetido ao uso de contrastes radiológicos nos 3 dias anteriores à coleta.

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