Tese Ana Esteves-19OUt

Tese Ana Esteves-19OUt

(Parte 1 de 6)

UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Ciências

Efeito dos androgénios na regulação do tónus da artéria umbilical, na hipertensão arterial da gravidez

Ana Filipa Silva Esteves

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Bioquímica (2º ciclo de estudos)

Orientador: Prof. Doutora Maria Elisa Cairrão Rodrigues Coorientador: Prof. Doutor José Ignacio Verde Lusquiños

Covilhã, outubro de 2013 i i

Dedicatória

À minha família pelo apoio, força, incentivo, companheirismo e amizade. Sem eles nada disso seria possível.

iv iv

Agradecimentos

Em primeiro lugar quero deixar aqui o meu sincero e especial agradecimento à

Professora Doutora Maria Elisa Cairrão Rodrigues por me ter confiado este projeto, pela orientação ao longo do mesmo, pelos ensinamentos teóricos e práticos que me facultou e pela paciência e disponibilidade demonstrados ao longo da minha adaptação às novas técnicas laboratoriais.

Agradeço ao Professor Doutor José Ignacio Verde Lusquiños, pelo apoio e disponibilidade para esclarecer e ensinar, sempre que se revelou necessário.

Um obrigado ao Professor Doutor Cláudio Maia pela paciência, ajuda, dedicação e conhecimentos teóricos e práticos transmitidos sobre o PCR em tempo real. O sincero meu agradecimento.

Agradeço à Ana Martinho pelo tempo disponibilizado a ensinar e discutir os dados obtidos no PCR em tempo real ao longo deste trabalho.

A toda a equipa do Centro de Investigação, que se mostraram disponíveis para ajudar sempre que foi necessário, em particular aos colegas de laboratório, Melissa, Joana e Paulo por todo o apoio técnico e científico.

Um agradecimento especial á Joana minha colega de laboratório e acima de tudo amiga. Nada disto seria possível sem o teu olhar crítico, as nossas conversas, as nossas risadas, contigo cresci como investigadora e pessoa. Foste o meu porto de abrigo quando as coisas não corriam pelo melhor caminho. Obrigada por tudo!

Às minhas amigas, Armanda Gonçalves, Cláudia Sousa, Tatiana Saraiva, por me ouvirem, ajudarem e apoiarem sempre que foi necessário. Vou ter muitas saudades dos nossos encontros nos corredores do CICS, dos nossos almoços, das nossas conversas e risadas. Um beijinho cheio de saudade.

Ao José Eduardo pela pessoa maravilhosa que é e por todo amor incondicional, carinho e força que me deu ao longo deste trabalho. És-me tudo!

Por fim um agradecimento especial a toda a minha família. Aos meus pais e à minha irmã, pela força e apoio que me deram, sem eles não seria possível concretizar esta longa caminhada. Também agradeço aos meus avós, tios e primos por me aconselharem e acreditarem em mim. Um beijinho para todos.

vi vi vii

Resumo

Nas últimas décadas, vários investigadores têm sugerido uma associação entre os androgénios e a hipertensão. Os efeitos benéficos dos androgénios no sistema vascular estão associados com a sua capacidade para provocar vasorelaxamento vascular. Os efeitos não genómicos dos androgénios nas células vasculares do musculo liso parecem ser devidos à ativação dos canais de potássio ativados pelo Ca2+ de elevada condutância (BKCa) e dos canais de potássio sensíveis à voltagem (KV) e/ou à inibição dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem tipo L (L-VOCC). Contudo os efeitos genómicos dos androgénios, nomeadamente na expressão destes canais iónicos, são pouco conhecidos. No entanto em estudos anteriores observou-se que os androgénios podem ser benéficos a nível cardiovascular pois têm efeitos vasodilatadores, e aumentam a expressão dos canais BKCa e dos Kv. A hipertensão é um dos problema mais comums na gravidez que complica 5% a 10% das situações de gravidez. Apesar da morbilidade significativa associada aos bebés nascidos de grávidas com hipertensão, a patogénese permanece por esclarecer, o que limita a capacidade de preveni-la e trata-la. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos genómicos dos androgénios na expressão de diferentes proteínas envolvidas na regulação da contrátilidade vascular, nomeadamente da guanilato ciclase solúvel (sGC), do recetor do péptido natriurético-A (NPRA) e da proteína cinase G (PKG). Estas proteínas parecem estar envolvidas no mecanismo vasodilatador provocado pelos androgénios. Este trabalho também teve como objetivo a comparação entre os níveis de expressão destas proteínas em artérias umbilicais humanas (HUA) provenientes de grávidas normotensas e de grávidas hipertensas. Para atingir estes objetivos foi utilisada a técnica de PCR em tempo real em células do músculo liso de HUA, as quais foram pré-incubadas durante 24 horas com DHT (1-1000nM).

Em células musculares de HUA provenientes de grávidas normotensas, os androgénios provocaram uma diminuição da expressão da sGC e da PKG, e um aumento na expressão do NPRA. No entanto, em células musculares de HUA provenientes de grávidas hipertensas os androgénios provocam uma diminuição da expressão da sGC, da NPRA e um aumento da expressão da PKG.

Em suma, podemos concluir que o DHT modula a expressão das proteínas analisadas, as quais estão envolvidas no mecanismo vasodilatador dos androgénios.

Palavras chave

Células musculares lisas vasculares, artéria umbilical humana, androgénios, hipertensão, efeitos genómicos, proteína cinase G, guanilato ciclase soluvel, recetor do péptido natriurético-A viii viii ix

Abstract

In recent decades, several researchers have suggested an association between androgens and hypertension. The beneficial effects of androgens in the vascular system are associated with their ability to cause vascular vasorelaxation. The non genomic effects of androgens in vascular smooth muscle appear to be due to activation of large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) and voltage gated potassium channels (KV) and/or the inhibition of L-type Ca2+ channels voltage dependent (L-VOCC). However, the genomic effects of androgens, particularly in the expression of these ion channels, are little known. However, in earlier studies it was observed that androgens may be beneficial to cardiovascular level because they have vasodilatory effects and increase the expression of

BKCa channels and Kv . Hypertension is one of the most comums problem in pregnancy that complicates 5 % to 10 % of cases of pregnancy. Despite the significant morbidity associated with babies born to pregnant women with hypertension, the pathogenesis remains unclear, which limits the ability to prevent and treat it. The aim of this study was to analyze the genomic effects of androgens on the expression of different proteins involved in the regulation of vascular contractility, including soluble guanylate cyclase (sGC), the natriuretic peptide receptor-A (NPRA) and protein kinase G (PKG). These proteins appear to be involved in the vasodilator mechanism induced by androgens. This study also aimed to compare the expression levels of these proteins in human umbilical artery (HUA) from normotensive and hypertensive pregnant women. To achieve these goals was used the technique of real time PCR in smooth muscle cells of HUA, which were preincubated for 24 hours with DHT (1-1000nM).

HUA muscle cells from normotensive pregnant women, androgens caused a decreased expression of sGC and PKG and an increase in the NPRA eexpression. However, in HUA muscle cells from pregnant hypertensive women androgens cause a decrease in expression of sGC and NPRA and an increased expression of PKG .

In sum, we conclude that DHT modulates the expression of the analyzed proteins, which are involved in vasodilator mechanism of androgens.

Keywords

Vascular smooth muscle cells, human umbilical artery, androgens, hypertension, genomic effects, protein kinase C, soluble guanylate cyclase, natriuretic peptide receptor-A x x xi

Agradecimentosv
Resumovii
Abstractix
Lista de figurasxiv
Lista de Tabelasxvi
Lista de acrónimosxvii
Capítulo I – Introdução1
1.1. Cordão Umbilical1
1.1.2. Artéria Umbilical Humana2
1.2. Músculo Liso4
1.2.1. Proteínas participantes no processo contrátil6
1.3. Canais Iónicos8
1.3.1. Canais de cálcio8
1.3.1.1. Canais De Cálcio Dependentes de Voltagem9
1.3.1.2. Canais de Cálcio Independentes de Voltagem1
1.3.2. Canais de potássio13
1.4. Mecanismos envolvidos no tónus vascular15
1.4.1. Mecanismo contrátil16
1.4.2. Mecanismo de relaxação17
1.5. Nucleótidos Cíclicos18
1.5.1. Guanilato Ciclase18
1.5.2. Proteína cinase G24
1.6. Androgénios26
1.6.1. Generalidades26
1.6.2. Mecanismo vasodilatador da testosterona28
1.6.3. Androgénios e as Doenças Cardiovasculares32
1.6.4. Androgénios e a Hipertensão32
1.7. Patologias da Gravidez3

Índice 1.7.1. Hipertensão ............................................................................................... 3

1.7.2. Pré-eclampsia34
Capítulo I – Objetivo35
Capítulo I – Materiais e Métodos36
2.1. Preparação do tecido36
2.2. Cultura de células36
2.3. Tratamento com 5α-DHT37
2.4. Extração do RNA total37
2.5. Síntese de DNA complementar38
2.6. PCR convencional39
2.7. PCR em tempo real39
2.8. Análise estatística40
Capítulo IV – Resultados43
4.1. Análise da expressão do mRNA da sGC43
4.2. Análise da expressão do mRNA do NPRA46
4.3. Análise da expressão do mRNA da PKG49
Capítulo V – Discussão52
Capítulo VI - Conclusões e Perspetivas Futuras56

xii Capítulo VII - Bibliografia ............................................................................................... 57 xiii xiii xiv

FIGURA 1 - CORTE TRANSVERSAL DO CORDÃO UMBILICAL2
FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA GERAL DE UMA ARTÉRIA3
FIGURA 3 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA CÉLULA MUSCULAR LISA4
FIGURA 4 – CARATERÍSTICAS ULTRAESTRURAIS DAS SMC COM FENÓTIPO CONTRÁTIL E SINTÉTICO5
FIGURA 5 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ORGANIZAÇÃO DOS FILAMENTOS FINOS E GROSSOS7
FIGURA 6 – ESTRUTURA ESQUEMÁTICA PROPOSTA PARA OS VOCC9

Lista de figuras

LISAS À ATIVAÇÃO DOS CANAIS DE POTÁSSIO OU INIBIÇÃO13
FIGURA 8 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO MECANISMO DE REGULAÇÃO DA CONTRAÇÃO DO MÚSCULO LISO17
FIGURA 9 – ESTRUTURA DA SGC19
FIGURA 10 - REGULAÇÃO DA SGC PELOS SEUS LIGANDOS20
FIGURA 1 - ESTRUTURA DA PGC2
FIGURA 12 - ESTRUTURA DOS RECETORES DOS NP23
FIGURA 13 - MODELO HIPOTÉTICO DA ATIVAÇÃO E DESSENSIBILIZAÇÃO DOS RECETORES NPR-A E B24

FIGURA 7 - ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS EVENTOS CHAVE ENVOLVIDOS NA RESPOSTA DAS CÉLULAS MUSCULARES

MÚSCULO LISO25
FIGURA 15 – MECANISMO DA FORMAÇÃO DA DIHIDROTESTOSTERONA, UM POTENTE METABOLITO DA TES27
FIGURA 16 – EFEITOS NÃO GENÓMICOS (ESQUERDA) E EFEITOS GENÓMICOS (DIREITA) DOS ANDROGÉNIOS28
FIGURA 17 - MECANISMO RÁPIDO DA TESTOSTERONA NAS HUASMC31

FIGURA 14 - PAPEL DO PKGI NA MODULAÇÃO DO NÍVEL DO CÁLCIO INTRACELULAR NA PROMOÇÃO DA RELAXAÇÃO DO

GRÁVIDAS NORMOTENSAS43

FIGURA 19 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS HIPERTENSAS4

FIGURA 20 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDÕES PROCEDENTES DE GRÁVIDAS HIPERTENSAS45

FIGURA 21 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS NORMOTENSAS46

FIGURA 2 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS HIPERTENSAS47

FIGURA 23 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDÕES PROVENIENTES DE GRÁVIDAS HIPERTENSAS48

FIGURA 24 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS NORMOTENSAS49

FIGURA 25 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

GRÁVIDAS HIPERTENSAS50

FIGURA 26 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE

FIGURA 27 - EFEITO DA 5Α-DHT NA EXPRESSÃO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDÕES PROCEDENTES DE GRÁVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDÕES PROVENIENTES DE GRÁVIDAS HIPERTENSAS ................ 51 xv xv xvi

TABELA 1 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS VOCC10

Lista de Tabelas

CODIFICAM PARA OS RECETORES DOS PÉPTIDOS NATRIURÉTICOS23

TABELA 2 - FENÓTIPOS DE RATOS E SERES HUMANOS COM MUTAÇÕES QUE LEVAM À INATIVAÇÃO DOS GENES QUE TABELA 3 - PRIMERS UTILIZADOS PARA PCR EM TEMPO REAL ............................................................................. 40 xvii

Lista de acrónimos

ANP péptido natriurético auricular (atrial natiuretic peptide) AR recetor de androgénios (androgen receptor) BNP péptido natriurético do cérebro (brain natriuretic peptide)

BKCa Canal de potássio ativado por cálcio de elevada condutância (Large conductance calcium-activated potassium channel)

CaM Calmodulina (Calmodulin) cGMP Monofosfato cíclico de guanosina ou Guanosina monofosfato cíclico (Cyclic Guanosine monophosphate) CNP péptido natriurético do tipo C (C-type natriuretic peptide) CVD Doença Cardiovascular (Cardiovascular disease) DAG Diacilglicerol (Diacylglicerol) DHP Di-hidropiridina GC Guanlilato ciclase (Guanylate cyclase) HVA Canais de alta voltagem (high voltage activated) HUA Artéria umbilical humana (Human Umbilical Artery) HUASMC Células Musculares Lisas da Artéria Umbilical Humana (Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells) HT Hipertensão ( Hypertension) IP3 1,4,5-Trifosfato de Inositol (Inositol-1,4,5-Triphosphate)

KATP Canais de potássio sensíveis a ATP (ATP –Sensitive Potassium Channels) KCa Canais de potássio activados por Ca2+(Calcium-Activated Potassium channels) KIR Canais de potássio rectificadores internos (Inwardly Rectifying PotassiumChannles)

KV Canais de K+ Operados por Voltagem (Voltage-Gated Potassium Channels) LVA Canais de baixa voltagem (low voltage activated)

L-VOCC Canal de cálcio dependente da voltagem do tipo-L (L Type voltage operated calcium channels)

MLC20 Cadeias Leves Reguladoras da Miosina (Myosin Regulatory Light Chains) MLCK Proteína Cinase da Cadeia Leve da Miosina (Myosin-Light-Chain Kinase)

MLCP Proteína Fosfatase da Cadeia Leve da Miosina (Myosin-Light-Chain Phosphatase) NCX Permutador Na+/Ca2+ (Na+/Ca2+Exchanger) NO Óxido Nítrico (Nitric Oxide) NPs Péptidos Natriuréticos (Natriuretic Peptides) NPRA recetor do péptido natriurético-A (natriuretic peptide receptor-A) NPRB recetor do péptido natrurétido-B (natriuretic peptide receptor-B) NPRC recetor do péptido natriurético-C (natriuretic peptide receptor-C) PE Pré-eclampsia pGC Guanilato Ciclase Membranar (Particulate Guanylyl Cyclase) xviii

PKC Proteína Cinase C (Protein Kinase C) PKG Proteína Cinase G (protein Kinase G or Cyclic GMP-dependent Protein Kinase) PLC Fosfolipase C (Phospholipase C) PMCA Ca2+ATPase da Membrana Plasmática (Plasma Membrane Ca2+ATPases) ROC Canais Operados por Receptores (Receptor-Operated Channels) ROCK Proteína cinase dependente da Rho-A (Rho-activated Kinase) SERCA Bomba de cálcio do retículo sarcoplasmática (Sarco/endoplasmatic reticulum Ca2+- activated ATPase) sGC Guanilato ciclase solúvel (Soluble guanylyl cyclase ) SMC – células musculares lisas (Smooth Muscle Cells) SOC Canal ativado pela depleção sarcoplasmática de cálcio (Store-operated channels) SUA Artéria umbilical única (single umbilical artery) Tes Testosterona T-VOCC Canal de cálcio dependente da voltagem tipo-T (T-type voltage operated calcium channels) VOCC Canais de cálcio dependentes de voltagem (voltage operated calcium channels) xix xix

Capítulo I – Introdução

1.1. Cordão Umbilical

Durante a gravidez existe uma estrutura que permite a ligação entre a mãe e o feto, e é responsável pelo transporte de sangue e nutrientes [1]. O cordão umbilical é uma estrutura vital para o crescimento e bem-estar do feto, começa a formar-se simultaneamente com a placenta na primeira semana de gestação e, apesar de provavelmente ser o único órgão que morre quando a vida começa, é uma das partes mais importantes da união feto-placentária [2]. Tem sido demonstrado que as alterações na morfologia e na constituição do cordão umbilical podem influenciar o curso da gravidez e o nascimento. Vários estudos demonstraram que a composição e o metabolismo alterado do cordão umbilical é frequentemente encontrado em certas doenças da gravidez como a pré-eclampsia (PE), diabetes, hipertensão (HT) entre outras [1, 2]. Esta é uma amostra biológica ideal para o estudo de patologias, pois é de fácil obtenção logo após o nascimento, e pode ser recolhida, sem riscos adicionais para a mãe ou para o feto [3].

No geral, um cordão umbilical normal tem um comprimento médio de 50 a 60 cm, e 1 a 2 cm de diâmetro, e pesa aproximadamente 40g. Porém, podem existir cordões umbilicais de diferentes tamanhos, podendo ser curtos ou longos, não sendo a sua ocorrência comum [1, 3]. Os cordões muito curtos podem causar a separação prematura da placenta da parede do útero, enquanto os cordões excessivamente compridos tem tendência a sofrer prolapso e/ou enrolarem-se em torno do feto e a formarem nós, sendo a sua identificação bastante importante de forma a evitar morte fetal resultante de anóxia fetal [4].

O cordão umbilical tem um aspeto esbranquiçado e é normalmente constituído por três vasos sanguíneos; duas artérias e uma veia, envolvidas por um tecido conjuntivo mucoso – a geleia de Wharton (figura 1) [1]. Contudo, já foram observados cordões umbilicais com apenas uma artéria. A presença de apenas uma artéria umbilical é a anomalia do cordão umbilical menos frequente, estimando-se que afete 0,5 a 2,5% de todas as gestações, e está associada a uma alteração cromossómica e a malformações cardíacas [5].

Figura 1 - Corte transversal do cordão umbilical. Adaptado de [6].

A geleia de Wharton constitui a maior parte do cordão umbilical humano e age como uma camada protetora. Apresenta um aspeto gelatinoso e é composta por algumas células estromais mesenquimais e uma matriz extracelular rica em água, glicosaminoglicanos, proteoglicanos (ácido hialurónico e condroitina sulfato) e diferentes tipos de colagénio [7, 8]. Quanto aos vasos umbilicais estes diferem na sua estrutura e na sua função, em comparação com os vasos principais do corpo. A veia umbilical tem maior diâmetro, e a parede mais fina, enquanto que as artérias, são mais estreitas e tem paredes mais espessas. As duas artérias umbilicais enrolam-se em volta da veia de um modo helicoidal e o sangue flui de um modo pulsátil do feto para a placenta, através destas. O retorno do sangue para o feto é feito através da veia umbilical [9].

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