Baixe Esterilização, Desinfecção, Microbiota do corpo. MICROBIOLOGIA e outras Trabalhos em PDF para Microbiologia, somente na Docsity! UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA UESB CURSO LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICA Anne Fabriele Alves Ferraz Iana Lare Gomes Santos Larissa Santos Rodrigues Mauricio de Oliveira Silva Queite Suele Costa de Souza Suzane Moreira dos Santos RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA Vitória da Conquista – BA Maio 2014 Anne Fabriele Alves Ferraz Iana Lare Gomes Santos Larissa Santos Rodrigues Mauricio de Oliveira Silva Queite Suele Costa de Souza Suzane Moreira dos Santos RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA Trabalho apresentado como pré-requisito de avaliação da disciplina de Microbiologia do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - Campus Vitória da Conquista, sob orientação da profª. Camila Pereira. Vitória da Conquista – BA Maio 2014 OBJETIVOS Objetivo Geral:  Compreender a literatura pesquisada; Objetivos específicos:  Conhecer algumas formas de controles microbianos;  Entender as técnicas de esterilização, desinfecção, assepsia e antissepsia;  Averiguar os vários tipos de meios de cultivo, vendo as características de cada um;  Observar a importância dos meios de cultura;  Verificar os tipos de microrganismos presentes na microbiota normal do corpo humano. PESQUISA TEÓRICA ESTERILIZAÇÃO A esterilização pode ser definida como o processo que mata ou remove todos os ti pos de microrganismos, inclusive os esporos bacterianos que são células de repouso muito resistentes. Os materiais (críticos e semicríticos) geralmente são submetidos à ação do calor seco (estufa) ou úmido (autoclave) ou ainda à ação de substâncias químicas (hipoclorito de sódio ou ácido peracético), porém estes métodos devem ser empregados corretamente para que possam representar um efetivo processo de esterilização. Esterilização é o processo que promove completa eliminação ou destruição de todas as formas de micro-organismos presentes: vírus, bactérias, fungos, protozoários, esporos, para um aceitável nível de segurança. O processo de esterilização pode ser físico, químico, físico- químico. A tabela 01 exemplifica algumas formas de esterilização. Critérios para sistemas de esterilização:  Uso de baixas temperaturas (menos de 60°C);  Ser compatível com diferentes materiais: plástico ou  Ser um método rápido; MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO ALTERNATIVAS Métodos físicos o Vapor saturado/autoclaves o Calor seco o Raios Gama/Cobalto Métodos químicos o Glutaraldeído o Formaldeído o Ácido peracético Métodos físicos químicos o Esterilizadoras a Óxido de Etileno (ETO) o Plasma de Peróxido de Hidrogênio o Plasma de gases (vapor de ácido peracético e peróxido de hidrogênio; oxigênio, hidrogênio e gás argônio) . o Vapor de Formaldeído Tabela 1: Métodos de esterilização.  Ser não tóxico para quem o manuseia;  Ser seguro aos materiais a serem esterilizados;  Ser seguro ao meio ambiente;  Não deixar resíduos no artigo;  Manter atividade frente a resíduos orgânicos;  Diminuir a margem de erro humano. Deve ser de fácil manuseio;  Uso único de esterilizante, evitando ser esta uma fonte de contaminação cruzada;  Ser de baixo custo operacional. Autoclavagem: Faz-se através da autoclave cujo funcionamento é idêntico ao da panela de pressão sendo a temperatura necessária para esterilização de 121° C, e o tempo de esterilização de cerca de 15 minutos. Este tempo de esterilização deverá ser aumentado quando se enche bastante a autoclave com meios para esterilizar. Objetivo: morte de todos os possíveis organismos vivos. As soluções ao sair da autoclave estão estéreis. Utiliza-se este tipo de esterilização pelo calor úmido para meios de cultura e diversas soluções. Existem vários tipos de autoclaves verticais ou horizontais. Figura 1- Autoclave vertical. Figura 2- Autoclave horizontal. Fonte: Thymol Autoclave India Fonte: Navyug Udyog Figura 5 - O ciclo de esterilização por óxido de etileno ocorre em câmaras vedadas certificadas e que atendem corretamente aos parâmetros requeridos. Fonte: Produmed Esterilização por energia ionizante: A esterilização e a descontaminação por energia ionizante através de raios gama é um método que consiste na exposição dos produtos à ação de ondas eletromagnéticas curtas, geradas a partir de fontes de Cobalto 60 em um ambiente especialmente preparado para esse procedimento. Como as ondas eletromagnéticas possuem grande poder de penetração, os organismos podem ser alcançados onde quer que estejam, tanto em embalagens lacradas como em produtos acondicionados das mais variadas maneiras, o que garante a total eficácia do processo. Essas ondas, ao encontrarem os micro-organismos vivos presentes no produto que está sendo tratado, provocam o rompimento de seu DNA, matando-os. Figura 6 - Esquema da utilização de raios ionizantes no processo de esterilização em grande escala na produção de material hospitalar. Fonte: Fisica (Radio) Activia. Tindalização: Este método consiste numa esterilização fracionada em que o meio sofre 3 aquecimentos em 3 dias consecutivos, para destruição de formas vegetativas bacterianas que evoluem de esporos. Utiliza temperaturas inferiores a 100 °C, e faz-se em banho- maria, onde se mergulham os frascos de meio a esterilizar hermeticamente fechados, durante cerca de 1h, repetindo-se o tratamento em 3 dias consecutivos. Objetivo: Eliminação de formas esporuladas, as quais germinam quando submetidas a temperaturas de 100ºC, resultando desta germinação as formas vegetativas não resistentes a essa temperatura. DESINFECÇÃO É um processo que destrói microorganismo, patogênicos ou não, com exceção dos esporos bacterianos, por meios físicos ou químicos. Níveis de Desinfecção:  Alto nível: destrói todos os microorganismos com exceção a alto número de esporos. Indicação: área hospitalar.  Médio nível: elimina bactérias vegetativas, a maioria dos vírus, fungos e micobactérias. Indicação: para UBS, creche, asilos, casa de repouso.  Baixo nível: elimina a maioria das bactérias, alguns vírus e fungos, mas não elimina micobactérias. Indicação: nutrição Pasteurização: Este processo foi desenvolvido pelo cientista francês Louis Pasteur (1822- 1895). Além de eliminar os agentes causadores de doenças, permite que os alimentos possam ser conservados por um tempo maior. A pasteurização é um tratamento térmico que elimina os micro-organismos termossensíveis (todos os patogênicos e outros não esporulados) existentes no alimento. A temperatura não passa dos 100°C, podendo este aquecimento ser produzido por vapor, água quente, radiações ionizantes, calor seco, micro-ondas, etc. Utiliza-se a pasteurização quando os tratamentos térmicos mais elevados trazem perdas de qualidade significativas, quando os agentes microbianos responsáveis pelas alterações no alimento não são muito termorresistentes ou quando deseja-se destruir agentes competitivos (ex: antes de uma fermentação). Exemplo de pasteurização no processamento de: catchup, cerveja, molho de pimenta, suco de laranja concentrado, vinagre de maçã, etc. Figura 7- Esquema do Processo de pasteurização. Fonte: Educadores dia-a-dia. ASSEPSIA Assepsia é um conjunto de procedimentos utilizados para impedir a penetração de microrganismos em objetos ou ambientes estéreis ou até mesmo quando se está trabalhando com culturas puras. Esses procedimentos envolvem o uso de ambiente apropriado, meios de cultura e instrumentais estéreis. Caso necessário usar luvas, máscaras e óculos protetores. Pipetar usando pipetadores automáticos ou pêras de borracha. Flambar as alças e agulhas, boca dos tubos, limpar e desinfetar periodicamente a bancada e o ar do ambiente de trabalho. Todas as operações envolvendo manipulação de culturas e meios de cultura deverão ser efetuados na área de proteção conferida pela chama do bico de Bunsen. A transmissão oral é reduzida pela separação entre as áreas de trabalho (laboratório) e as áreas de lazer. Da mesma maneira, as áreas laboratoriais devem ser separadas das áreas de alimentação, onde são ingeridos os alimentos. Não se deve fumar, mascar ou beber no laboratório. Também, cosméticos não devem ser aplicados nas áreas laboratoriais. A pipetagem pela boca não é permitida e onde for necessário deve-se usar luvas. Usar sempre avental de laboratório, de preferência do tipo Howie (avental com gola fechada através de botões de pressão e de mangas com elástico nas extremidades) e gorros, se necessário. O pessoal do laboratório deve lavar e/ou fazer a correta antissepsia das mãos sempre que houver suspeita de contaminação e antes de deixarem o laboratório. A transmissão por aerossóis pode ocorrer durante o uso de alças bacteriológicas, principalmente se são muito longas e de grande diâmetro, devido à vibração durante o uso. Para minimizar esse risco a alça deve ter de 2 a 3 mm de diâmetro e devem estar completamente fechadas e, de preferência, deve-se usar agulhas ou alças de platina, pois vibram menos que a de níquel-cromo. A flambagem das alças pode gerar aerossóis, razão pela qual deve ser utilizado microincineradores, especialmente se o microrganismo envolvido é transmitido pela via ocular ou trato respiratório. Também podem ser gerados aerossóis quando alças ou agulhas quentes são contatadas com culturas. O uso de microincineradores para flambagem de instrumentais contendo microrganismos patogênicos como as micobactérias (ou outras bactérias que apresentam elevado conteúdo de lipídios) reduz a contaminação do laboratorista e do ambiente. Os microincineradores atuais são constituídos de um cone contendo resistência elétrica que atinge temperaturas de cerca de 850°C. Também podem formar aerossóis quando são realizados movimentos bruscos na homogeneização durante realização de reações de aglutinação ou na preparação de esfregaços. A centrifugação de amostras de pacientes suspeitos de albergar microrganismos do Grupo 3, bem como o manuseio de culturas desses microrganismos devem ser efetuados em capines de classe biológica III, cujo ar é drenado para a cabine e exaurido por um filtro HEPA. As áreas de trabalho devem ser desinfetadas com solução de hipoclorito a 0,5%, glutaraldeído ou salina-formol (10%) para redução de riscos. Tabela 2. Classificação das cabines de laboratório com relação à biossegurança Classe Patógeno Origem do fluxo de ar Saída do ar Proteção do experimento Proteção do laboratorista I 2,3 Ar ambiente Filtração HEPA +/- ++ II 2,3 Ar ambiente Filtrado HEPA Idem ++ + III 2,3,4 Idem Idem ++ +++ Os riscos de transmissão de microrganismos (Vírus da Hepatite B, HIV e Tripanosomas) por via parenteral são minimizados através do uso de luvas de látex para manuseio dos materiais ou culturas contendo esses microrganismos. Restringir o uso de agulhas, lâminas de bisturi e objetos cortantes e, quando possível substituir vidro por plástico, descontaminar amostras com glutaraldeído ou hipoclorito, sem comprometer os resultados da investigação. Manter frascos quebrados ou objetos agudos descartados em recipientes resistentes de plástico ou de papelão especial e que possam reter líquidos, i.e., impermeáveis a líquidos. Uso de óculos e/ou máscara protetoras para os olhos e narinas no sentido de evitar contaminação pelas vias aérea e ocular (toxina botulínica e microrganismos relacionados acima). ANTISSEPSIA É o processo utilizado para inibir o crescimento de formas vegetativas de microrganismos patogênicos na superfície corporal do homem e animais. Muitas vezes a antissepsia destoe formas vegetativas de microrganismos patogênicos, mas usualmente não elimina esporos. As substâncias químicas usadas são chamadas antissépticas. Um bom antisséptico para as mãos deve destruir a microbiota patogênica ou inibir a sua multiplicação bem como deve reduzir a microbiota total em cerca de 99,9%, i.e., 3 a 5 reduções decimais. Ë obrigação da instituição em que se trabalha fornecer um ambiente seguro. Isso inclui o fornecimento de procedimentos gerais de biossegurança, manutenção da organização escrita e todos os arranjos necessários para implementar os procedimentos de segurança. Para tanto, cada laboratório deve criar suas normas locais próprias, de acordo com o tipo de trabalho desenvolvido, seguindo as recomendações dos órgãos e comissões de biossegurança. Figura 12- Uso de EPI (equipamentos de proteção individual), estrutura adequada para fazer os experimentos e manipulação de culturas, seguindo os requisitos de assepsia. Fonte: Biosafety level wikispaces Figura 13- A lavagem das mãos é uma forma de antissepsia, o uso de sabões e outros produtos de limpeza devem ser efetuados. Fonte: Anvisa etc.). A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos. Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uréia, etc.); Identificação - prestam-se para a realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação (meios Oxidação/Fermentação, Ágar Citrato, Caldo nitrato, meio semi-sólido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade. Dosagem - empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos; Contagem - empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, Ágar Baird-Parker, etc.); Estocagem ou manutenção - utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, i.e. garantem a viabilidade de microrganismos (Ágar Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio semi-sólido, etc.). O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.  Ágar nutriente (AN): Meio relativamente simples, de fácil preparo e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de microbiologia. Utilidade: análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras, conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da criopreservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC) e observação da esporulação de espécies de bacilos Gram positivos. Interpretação: o Cor original do meio: branco opalescente o Positivo: Crescimento na superfície do ágar; o Negativo: Ausência de crescimento. Figura 14 - Quatro placas de ágar nutriente crescente colônias de bactérias Gram negativas comuns. Fonte: The Diagnostic Scheme.  Ágar sangue (AS): O meio, usando uma base rica, oferece ótimas condições de crescimento à maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. eStaphylococcus spp. Utilidade: isolamento de microrganismos não fastidiosos, verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. e usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.). Interpretação: o Cor original do meio: vermelho. o Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos eritrócitos). o Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). o Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros). Figura 15 - α-Hemólise em meio Agar sangue. Colônias de Streptococcus pneumoniae (Colônias pequenas, planas, bordos irregulares, achatadas e brilhosas). Fonte: Micro didática  Ágar chocolate (CHOC): Amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresçam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Utilidade: crescimento de microrganismos exigentesHaemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. Interpretação: o Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). o Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. o Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp. Figura 16- Estrias adequada e crescimento de H. influenzae em um CAP, em um meio de cultura ágar chocolate. Fonte: Cdc gov meningitis lab manual Figura 19 - Salmonella entérica em ágar Hektoen entérico, Greenish colônias são formadas. Fonte: Bio chemical tests Project  Ágar Cystine Lactose Electrolyte Deficient (CLED): Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. Utilidade: isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. Interpretação: o Cor original do meio: azul claro. o Colônias lactose positiva: cor amarela. o Colônias lactose negativa: cor azul. Figura 20 - Aeromonas hydrophila de um paciente com diarreia grave, isoladas em C.L.E.D. agar. Fonte: Flickriver  Ágar Thayer-Martin Chocolate (TM): É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados. Utilidade: usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigação. Interpretação: o Cor original do meio: marrom-chocolate o Colônias pequenas e opacas: suspeita de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. Figura 21 - Meio Thayer-Martin Chocolate (TM) positivo revelando bactérias N. gonorrhoeae. Fonte: Meducation  Ágar Löwenstein-Jensen (LJ): A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis). Utilidade: Isolamento primário das micobactérias. Interpretação: o Cor original do meio: verde claro o Positivo: Crescimento de colônias amarelas o Negativo: ausência de crescimento. Figura 22 – Cultivo e isolamento de Mycobacterium spp em Lowenstein-Jensen Médio (LJ). Fonte: Fisher scientific  Ágar Saboraud (AS): Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos. Utilidade: cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais e caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante). Interpretação: o Cor original do meio: amarelo claro opalescente. o Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu. Figura 23 – Meio ágar Saboraud com bactéria Candida albicans Fonte: Biosystems  Ágar Regan-Lowe (RL): Consiste em uma base de carvão vegetal acrescida de sangue (carneiro ou cavalo) e cefalexina. O carvão e o amido atuam como absorventes, MICROBIOTA OU FLORA NORMAL Os animais e os seres humanos quando no útero materno estão isentos de microrganismos. Ao nascimento, populações microbianas normais se estabelecem de imediato. Essa aquisição ocorre por uma transmissão horizontal. Quando a criança passa pelo trato vaginal da mãe, que é um local de multiplicações intensas de lactobacilos, ocorre o primeiro contato com os microrganismos. A partir daí, várias sucessões que vão desde o nascimento até fases diversas da vida adulta conclui no desenvolvimento da microbiota normal. Chama-se microbiota o conjunto dos microrganismos que estão associados a tecidos ou órgãos de animais ou plantas. Os microrganismos que estabelecem residência permanente (colonizam), mas não geram doenças, em condições normais, no seu hospedeiro são chamados de microbiota normal, ou flora normal. Uma vez estabelecida, a microbiota normal pode haver benefícios para o hospedeiro impedindo o crescimento de microorganismos perigosos. Esse fenômeno é conhecido como antagonismo microbiano ou exclusão competitiva. Isso significa uma competição entre os micróbios por nutrientes. Ex.: a microbiota bacteriana normal da vagina de uma mulher adulta mantém o pH local em torno de 4,0. A presença da microbiota normal inibe o crescimento excessivo da levedura Candida albicans, que pode crescer quando o equilíbrio entre a flora normal e os patógenos é alterado e o pH modificado. Se a microbiota normal vaginal é eliminada pelo uso de antibióticos, pelo uso excessivo de ducha higiênica ou desodorantes, o pH pode ser conduzido até a neutralidade, possibilitando o crescimento e a predominância da C. albicans no local e a ocorrência de vaginite. Outro exemplo de antagonismo microbiano ocorre no intestino grosso. Células de E. coli produzem bacteriocinas, proteínas que inibem o crescimento de outras bactérias da mesma espécie ou proximamente relacionadas, como as bactérias patogênicas Salmonella e Shigella. Existem também outros tipos como: Microbiota Residente – a microbiota residente, formada por diversos tipos de microorganismos relativamente fixos, encontrados com regularidade em certos locais e em determinada idade, mas quando destruída, se recupera rapidamente. Microbiota Transitória – a microbiota transitória, constituída de organismos não patogênicos ou potencialmente patogênicos que permanecem na pele ou nas mucosas por horas, dias ou semanas, oriundas do ambiente, não produzem enfermidade e nem se estabelece de forma permanente na superfície. De um modo geral, os membros da microbiota transitória possui pouca importância, enquanto a microbiota residente permanece intacta. No caso da microbiota residente sofrer agravos, os micróbios transitórios podem colonizar e proliferar, produzindo doenças. Microbiota Comensal ou Simbiôntica – praticamente todas as partes do corpo humano são habitadas por germes, só se salvando os tecidos internos como o sangue (mesmo assim pode possuir uma microbiota transitória), algumas partes do trato urinário, trato respiratório inferior e bexiga. Pode–se afirmar que a microbiota normal pode ser usada como sinonímia da microbiota comensal ou simbiôntica. Sabemos hoje que somos colonizados por microrganismos. Estima-se que o corpo humano que contém 10 trilhões de células seja portador de 100 trilhões de bactérias. Os microrganismos estão presentes formando comunidades heterogêneas e em superfícies corporais bastantes específicas, eles colonizam apenas sítios do corpo que podem supri-los com nutrientes apropriados. Esses nutrientes podem ser derivados de produtos celulares secretados ou excretados, substâncias de fluídos corpóreos, células mortas e alimentos no trato digestório. Exemplo: pele, superfícies mucosas (boca, vagina, olhos) e no trato gastrintestinal. Os fatores que controlam a microbiota em uma região do corpo estão relacionados com a natureza do ambiente local, tais como temperatura, PH, água, oxigenação, nutriente, luz solar, salinidade e fatores mais complexos como a ação de componentes do sistema imunológico. Os principais filos que habitam o corpo dos seres humanos são: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacterias e as Proteobacterias, conforme mostra na figura 27. Figura 27: Mucosa normal do intestino delgado e a presença dos lactobacillus necessários para o bom funcionamento intestinal normal. Fonte: Medicina Prática Figura 28: Esquema da distribuição sítio-específica dos filos bacterianos em um ser humano saudável Fonte: Scienceblogs Flora normal do olho: As bactérias do olho são similares àquelas encontradas na pele (há relação entre o S. aureus na pele e a sua presença no olho) e vias aéreas superiores, além das bactérias Gram negativas mais comuns do TGI que também são isoladas nos olhos; mas as bactérias encontradas normalmente no ar são, raramente, isoladas no olho. Acredita-se que os cílios tenham um papel importante na manutenção da flora do olho; acredita-se também que os olhos nunca estão desprovidos de Staphylococcus porque a fonte de contaminação está sempre presente. Não existe diferença entre a flora ocular de homens e mulheres e não há modificação da flora com a idade do indivíduo, exceto um aumento no número de Difteróides em indivíduos com 50 anos ou mais (Corynebacterium xerosis). Na idade de 0 a 1 ano as bactérias que predominam são: Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Neisseria catharralis, Veilonella, Nocardia,Actinomicetos, Escherichia, Fusobacterium, Bacterioides, Leptotrichia e leveduras. A presença de dentes não é necessária para a instalação de bactérias filamentosas (Fusobacterium, Actinomyces, Leptotrichia). O Streptococcus sanguis se estabelece após erupção dentária. As cáries também fornecem novos substratos e um pH ácido, além de dificultar a exposição de microrganismos aos agentes antimicrobianos da saliva. A placa dentária contém Streptococcus, Neisseria, Veilonella, Actinomyces e Gram negativos. O pH da saliva ( 5,7 - 7,0) parece ter importância na manutenção da flora normal. Outros fatores para a manutenção desta flora são as vitaminas do complexo B e a mucina juntamente com carboidratos. Os Lactobacillus,spp são em pequeno número e só aumentam na presença de cáries CONSIDERAÇÕES FINAIS Os métodos de esterilização, desinfecção e assepsia são eficazes na eliminação e diminuição de microrganismos, evitando assim infecções e contaminações de materiais e pessoas em laboratórios. A Estufa e Autoclave são os métodos de esterilização mais utilizados por serem os mais eficientes na eliminação de micro-organismos, além de serem mais baratas e menos tóxicas. O sucesso nos processos de desinfecção e esterilização depende da correta e criteriosa escolha, aplicação e observação das características peculiares de cada agente químico e dos fatores interferentes. Os meios de cultura basicamente são utilizados para fornecer o ambiente adequado para a ocorrência de determinados fenômenos científicos, bem como reações químicas, biológicas e alterações físicas. A maioria dos microorganismos da flora normal são bactérias, a formação desta flora ocorre no momento do nascimento ao passar pelo canal do parto e continua por toda a vida, distribuindo-se pelas partes do corpo que estão em contato com o meio externo, que são pele e mucosas. O número e as espécies que formam a flora microbiana normal variam de acordo com a região do corpo e com a idade do hospedeiro, e às vezes o sexo do hospedeiro. Porém algumas regiões do corpo estão livres de microorganismos como o sangue, bexiga, útero, ouvido médio, rins, seios paranasais, trompas e fluido cerebroespinhal. AULA PRÁTICAS INTRODUÇÃO Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação e a correta caracterização cultural do organismo em meios de isolamento primário, assim como a execução e interpretação da coloração e reação ao Gram são vitais para o sistema de identificação. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou semeadura, utilizando a técnica do esgotamento do inoculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação das bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma colônia. O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio). Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial: Forma; tamanho (mm); elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, etc; Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para observação da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou ausência de esporos, flagelos, cápsulas, granulações e coloração bipolar (frequente nas pasteurelas e yersinias). Em microbiologia existem testes que são fundamentais para identificações de bactérias, um deles é o teste de catalase que consiste na detecção da enzima catalase em bactérias é realizado com peróxido de hidrogênio (H2O2) sobre a lâmina. A catalase é produzida por muitos microrganismos e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos e Streptococcus que são catalase negativos. Outro teste é o coagulase, usado para verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo. As coagulases são enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de um mecanismo similar ao da coagulação normal. A atividade da coagulase é utilizada para distinguir espécies patogenicas de Staphylococcus de espécies não patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus. Métodos: Para confecção do swab (usado para coletas das colônias de bactérias) utilizou- se palitos de churrasco e algodão, enrolando o algodão no palito. Feito isso, os swabs foram colocados em tubos de ensaio, tampados com algodão e postos em um Becker de vidro que foi empacotado com um plástico apropriado para levar à autoclave para total , para total esterilização do conteúdo do pacote. Foram preparados dois meios de cultura:  Pesou-se 5g de glicose, 5g de ágar, 5g de peptona de carne e mediu-se 250 ml de H2O destilada.  Para o preparo do segundo meio foram pesados 7,8 g de Miller-Hinten e acrescentado 250 ml de H2O destilada. Estes dois meios de cultura também foram levados para a autoclave onde permaneceram por 15 minutos (fig. 29) Após o tempo estimado foi realizado então o plaqueamento, que consiste em colocar os líquidos preparados em placas de petri, e em seguida cobri-las com a tampa apropriada e aguardar até que os meios esfriassem e obtivessem consistência gelatinosa. Os meios então foram guardados em plástico lacrado virado para baixo e colocados na geladeira. Passados uma semana, coletaram-se prováveis colônias de bactérias de vários meios, cabelo, pé, unhas, bebedouro, teclas de caixa eletrônico, couro cabeludo (fig.30), da cantina da Universidade, das mãos sem lavar e lavadas, do celular etc... Feito isso, realizou-se a técnica de semeadura de esgotamento, que consiste na transferência de um meio de cultura no caso o swab para outro meio de cultura, o Miller-Hinten ou para ao meio de peptona de carne (fig. 31). Após o esgotamento, flambou-se a alça bacteriológica de metal levando-a ao fogo até que o metal obtivesse um aspecto rubro para assim esteriliza-la (fig. 32). Em seguida, esfriou-se a alça em um canto da placa de petri contendo um dos dois o meios de cultura e posteriormente foi passada suavemente sobre o local de esgotamento das colônias de bactérias deslizando sobre o meio de cultura fazendo estrias sucessivas (zig-zag), em um único sentido aproveitando todo espaço da placa até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra (fig. 33). Esse processo foi repetido diversas vezes até todas as bactérias que foram coletadas para análise estarem esgotadas nas diversas placas de petri. Logo após, todas as placas foram empacotadas novamente e guardadas na geladeira onde permaneceram por 15 dias. Após este tempo as placas foram retiradas da geladeira, para posteriores observações de crescimentos das colônias de bactérias (fig 34 e 35). Após possíveis observações, as colônias de bactérias que cresceram foram coletadas da placa de petri para fixação nas laminas, esse processo se iniciou com a flambagem da alça bacteriológica de metal, que depois de esterilizada e esfriada em um Becker com água destilada, colocou-se uma gota dessa água no centro de uma lâmina, em seguida coletou-se uma pequena porção do crescimento microbiano com a alça de metal (fig. 36) e colocou-a no centro da lâmina, ainda como o auxilio da alça de metal realizou-se movimentos de rotação na lâmina homogeneizando a colônia de bactéria, para dessa forma se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, para finalizar esse processo, fixou o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 3 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente) (fig. 37), em seguida seria feita a coloração de Gram nessas lâminas, no entanto, no laboratório não tinha o corante, por isso, foi impossível realizar a coloração, assim as lâminas fixadas foram embrulhadas e enroladas em papel toalha para coloração em próxima aula. Ainda utilizando as colônias de bactérias realizou-se o teste de catalase e de coagulase para identificarmos as bactérias, primeiro realizou-se o teste de catalase em que se coletou uma quantidade pequena de bactérias das colônias plaqueadas e em seguida elas foram colocadas na lâmina, feito isso, esterilizou-se a alça de metal no fogo e, uma vez esterilizada ela foi utilizada para coleta do Peróxido de Hidrogênio que foi colocado sobre a colônia que estava na lâmina, para assim observamos a possível reação. Em seguida, realizou-se o teste de coagulase, em que se utilizou o plasma sanguíneo, pegou-se a alça de metal esterilizada coletando uma pequena quantidade do plasma em um tubo, colocando-o sobre uma colônia de bactéria que estava sobre a lâmina, para dessa forma observarmos o resultado que o plasma causaria sobre a colônia de bactéria. Figura 29 - Autoclave contendo os swabs e os meios de cultura para esterilização. Figura 30: Coleta de prováveis bactérias do couro cabeludo. Fonte: Autoria do grupo Fonte: Autoria do grupo Figura 31 – Técnica de semeadura de esgotamento. Figura 32- Flambagem da alça de metal Fonte: Autoria do grupo. Fonte: Autoria do grupo. bactérias, servindo essencialmente para a distinção entre estafilococos e estreptococos. Se aparecem bolhas, o organismo é catalase-positivo (possui catalase, caso dos estafilococos), se não é catalase-negativo (estreptococos). As bolhas são formadas pelo oxigénio molecular libertado na reação da catalase. Ao realizarmos o teste de catalase obtemos os seguintes resultados (fig.38 e 39) quanto à reação do peróxido de hidrogênio na colônia de bactéria, salientando que foram realizados com apenas algumas amostras e não com todas. Tabela 3: Resultado do teste de catalase quanto as colônias de bactérias dos locais coletados, e seus respectivos tipos de bactérias. Algumas células do sistema imunitário produzem peróxido de hidrogénio para uso como agente antibacteriano. As bactérias patogénicas que possuem catalase são capazes de resistir a este ataque graças à presença da enzima, conseguindo sobreviver nas células que invadem. Já em relação ao teste de coagulase, não obtivemos resultado positivo quanto a reação, já que o tempo era pouco para a realização do teste e visto isso, não detectamos nenhum possível resultado para as bactérias que foram submetidas ao plasma sanguíneo, considerarmos artificialmente que todos foram negativos. Figura 37 - Medição do diâmetro da colônia de bactéria do dedão do pé Fonte: Autoria do grupo. Locais da Colônia de bactérias Resultado da Catalase Tipo de bactéria Orofaringe Positivo Estafilococos Orelhas Positivo Estafilococos Nariz Negativo Estreptococos Pés Positivo Estafilococos Figura 38 – Teste de catalase positivo (bolhas). Fonte: Autoria do grupo. Figura 39 – Teste de catalase positivo (bolhas). Fonte: Autoria do grupo. 47 CONSIDERAÇÕES FINAIS As bactérias tem grande facilidade de se desenvolverem em ambientes externos e internos. Quando se trata da identificação das colônias de bactérias que foram isoladas em um meio de cultura, logo é possível observar características determinantes a elas apenas a olho nu, uma vez que não tivemos acesso à lupa no laboratório, dessa forma foi possível averiguarmos que as variadas bactérias que conseguiram desenvolver nos meios às quais foram postas apresentavam diversos aspectos morfológico quanto ao tamanho (pequeno, médio e grande), forma e coloração cor branca, e que para uma melhor observação dessas características é viável observar pelo microscópio após a realização de esfregaços e colorações especiais. Quando nos deparamos com um material biológico, a fim de identificar os tipos bacterianos presentes ali, vários métodos de identificação, de isolamento, diferenciais e seletivos são utilizados, porém os testes bioquímicos são de fundamental importância, uma vez que podemos identificar bactérias que possuem mecanismos de fuga do Sistema Imune com base nas enzimas que elas produzem.