Sífilis - Manual Aula 2 DIAGNOSTICO DA SIFILIS

Sífilis - Manual Aula 2 DIAGNOSTICO DA SIFILIS

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1Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Aula 2Diagnóstico da sífilis

Testes para o diagnóstico da sífilis

Para o diagnóstico da sífilis podem-se utilizar os testes treponêmicos e os não treponêmicos. Neste etapa dos estudos você conhecerá mais sobre cada um deles e sua importância no diagnóstico das diferentes fases de evolução da sífilis.

Testes treponêmicos São testes que detectam anticorpos contra antígenos do Treponema pallidum.

Estes testes são qualitativos. Eles definem a presença ou ausência de anticorpos na amostra.

Testes não treponêmicos

São testes que detectam anticorpos não treponêmicos, anteriormente denominados anticardiolipínicos, reagínicos ou lipoídicos. Esses anticorpos não são específicos para Treponema pallidum, porém estão presentes na sífilis. Os testes não treponêmicos podem ser:

• qualitativos – rotineiramente utilizados como testes de triagem para determinar se uma amostra é reagente ou não;

• quantitativos – são utilizados para determinar o título dos anticorpos presentes nas amostras que tiveram resultado reagente no teste qualitativo e para o monitoramento da resposta ao tratamento. O título é indicado pela última diluição da amostra que ainda apresenta reatividade ou floculação visível.

2Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

O fenômeno de prozona

Trata-se da ausência de reatividade em uma amostra que, embora contenha anticorpos não treponêmicos, apresenta resultado não reagente quando é testada sem diluir – ou mesmo em baixas diluições. Esse fenômeno decorre da relação desproporcional entre as quantidades de antígenos e anticorpos presentes na reação não treponêmica, gerando resultados falso-negativos. Ocorre nas amostras de pessoas com sífilis, em virtude da elevada quantidade de anticorpos presentes.

O fenômeno de prozona não é observado nos testes treponêmicos. É observado principalmente na sífilis secundária, fase em que há produção de grande quantidade de anticorpos. Além disso, o fenômeno é facilmente identificado fazendo-se o teste qualitativo com a amostra pura e diluída a 1:8 ou a 1:16.

Diferenças entre os testes não treponêmicos e os treponêmicos

A diferença principal é que os testes não treponêmicos detectam anticorpos que não são específicos contra Treponema pallidum, e os testes treponêmicos detectam anticorpos específicos para antígenos de T. pallidum. Podem ocorrer resultados falso-positivos em diferentes situações, tendendo a apresentar títulos baixos nos testes não treponêmicos.

Resultados falso-positivos podem ser permanentes:

• em portadores de lupus eritematoso sistêmico;

• na síndrome antifosfolipídica e em outras colagenoses;

• na hepatite crônica;

• em usuários de drogas ilícitas injetáveis;

• na hanseníase;

• na malária.

Resultados falso-positivos podem também ocorrer transitoriamente:

• em algumas infecções; • após vacinações;

• no uso concomitante de medicamentos;

• após transfusões de hemoderivados;

• na gravidez;

• em idosos.

Testes não treponêmicos apresentam mais resultados falso-positivos que os testes treponêmicos. Cerca de 1% da população apresenta reatividade nos testes treponêmicos sem ter a infecção. No exame FTA-abs, as reações falso-positivas habitualmente apresentam os treponemas com um padrão atípico de fluorescência em forma de contas. Isso ocorre, por exemplo, na borreliose de Lyme. Neste caso, o FTA-abs é reagente e o VDRL geralmente é não reagente.

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Técnicas utilizadas nos testes para o diagnóstico da sífilis

Apresentamos a seguir as diferentes metodologias utilizadas nos testes existentes para o diagnóstico da sífilis:

Pesquisa direta do T. pallidum:

Técnica Testes

MicroscopiaA fresco em campo escuro

Coloração (Fontana-Tribondeaux ou Imunfluorescência Direta)

Quadro 1 – Técnicas para pesquisa do T. pallidum. Nos testes não treponêmicos:

Técnica Testes

FloculaçãoVDRL (Venereal Disease Laboratory)

RPR (Rapid Test Reagin) USR (Unheated Serum Reagin) TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)

AglutinaçãoTestes Rápidos – TR Imunoenzimáticos (ELISA)ELISA (Enzyme – linked immunossorbent assay)

ImunocromatográficosTestes Rápidos – TR Quadro 2 – Técnicas para testes não treponêmicos.

Nos testes treponêmicos:

Técnica Testes

Imunofluorescência indireta FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody absorption) HemaglutinaçãoMHA-TP (microhemaglutinação para Treponema pallidum) Aglutinação de partículasTPPA (Treponema pallidum particle agglutination assay)

Imunoenzimáticos e suas variações

ELISA (Enzyme-linked immunossorbent assay), CMIA (Ensaio imunológico quimioluminescente magnético)

Imunocromatografia Testes rápidos

Testes molecularesReação de amplificação do DNA da bactéria como a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Quadro 3 – Técnicas para testes treponêmicos.

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Exames laboratoriais para o diagnóstico da sífilis primária Esses exames são de dois tipos:

• Exame direto realizado com amostra coletada diretamente da lesão – exame de microscopia que permite a identificação de Treponema pallidum. A microscopia pode ser realizada para a pesquisa do treponema em campo escuro, após a coloração pelo método de Fontana-Tribondeaux ou pela imunofluorescência direta.

• Exames sorológicos – embora o tempo para o surgimento dos anticorpos possa variar de pessoa a pessoa, a partir de 10 dias da evolução do cancro duro é possível obter reatividade nos testes sorológicos. O FTA-abs é o primeiro teste a se tornar reagente na sífilis.

Teste não treponêmico de floculação e seus procedimentos

Você vai conhecer agora detalhes das metodologias dos testes não treponêmicos, seu funcionamento, suas indicações de uso e os cuidados necessários para obter resultados precisos e confiáveis.

Testes de floculação

Os testes de floculação baseiam-se em uma suspensão antigênica que contém cardiolipina, colesterol e lecitina.

No preparo da suspensão antigênica, a ligação desses componentes ocorre ao acaso e resulta na formação de estruturas arredondadas denominadas micelas, conforme você pode ver na figura adiante.

Cardiolipina Lecitina

Colesterol

Figura 1 – Representação esquemática do antígeno dos testes não treponêmicos, na forma de micelas.

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1 - cardiolipinas – são lipídios encontrados em baixas concentrações em tecidos de mamíferos. A cardiolipina sódica obtida de coração de boi é utilizada no preparo do antígeno VDRL.

Os anticorpos não treponêmicos presentes na amostra ligam-se às cardiolipinas1 das micelas.

A ligação de anticorpos em várias micelas resulta na floculação, que pode ser observada ao microscópio. Veja a figura a seguir, que representa a ligação de várias micelas por meio dos anticorpos.

Essa ligação é encontrada na forma de flocos ou grumos, grandes ou pequenos, que podem ser visualizados a olho nu em alguns testes e em outros com auxílio de microscópio.

Veja na figura adiante algumas fotos da reação de VDRL observadas em microscópio óptico comum em aumento de 100 vezes.

Agora, confira o quadro a seguir, que expõe de modo sistematizado os testes de floculação e sua composição antigênica.

Anticorpos não treponêmicos

Cardiolipina

Lecitina Colesterol

Figura 2 – Representação esquemática de uma reação de floculação na qual os anticorpos não treponêmicos ligam-se simultaneamente em várias micelas.

Presença de floculaçãoAusência de floculação Figura 3 – Observação de floculação e da ausência de floculação na reação de VDRL.

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Teste Composição antigênica

VDRL (Venereal Disease Laboratory) • cardiolipina (0,03%);

RPR (Rapid Plasma Reagin) • cardiolipina;

USR (Unheated Serum Reagin) • cardiolipina;

TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test) • cardiolipina;

Observe no quadro a seguir, os tipos de amostras e as exigências de cada teste de floculação.

Características Testes Tipo de amostra que pode ser utilizadaVDRLRPRUSRTRUST

Líquor Sim Não Não Não

Plasma Não Sim Não Sim Soro Sim Sim Sim Sim

Exigências de cada testeVDRLRPRUSRTRUST O teste requer inativação da amostraSimNãoNãoNão

Antígeno já está pronto para usoNãoSimSimSim Leitura em microscópioSimNãoSimNão Leitura a olho nuNãoSimNãoSim Teste qualitativo e quantitativoSimSimSimSim

Estabilidade da suspensão antigênica8 horasMesesMesesMeses Quadro 4 – Tipos de amostras e as exigências de cada teste

Quadro 4 – Testes de floculação e sua composição antigênica.

7Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Escolha do teste de floculação para diagnóstico da sífilis

A escolha do teste não treponêmico depende das características do seu serviço, como:

• o tipo de amostra a ser testada (líquor, soro ou plasma); • equipamentos disponíveis (banho-maria, microscópio);

• tamanho da rotina.

Outro fator a ser considerado na hora de escolher é a qualidade do teste2. Antes de adquirir o conjunto diagnóstico para sífilis, certifique-se da qualidade do produto, solicitando ao fornecedor um kit para avaliar o desempenho.

Verifique a validade da suspensão antigênica e dos outros insumos em cada conjunto diagnóstico. Siga rigorosamente as instruções de cada fabricante.

2 - Na aula 5 deste curso você encontrará informações de como realizar o controle de qualidade dos testes de floculação.

O VDRL é o único teste de floculação que pode ser utilizado para a pesquisa de anticorpos não treponêmicos no líquor.

8Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Reação de VDRL com amostra de soro

O VDRL é um teste não treponêmico muito utilizado no Brasil. Você conhecerá a partir de agora, em detalhes, a reação do VDRL feita com a suspensão antigênica preparada com base no antígeno concentrado para o teste em amostras de soro.

Confira a seguir a sequência de nove ações recomendadas para você adotar em um teste VDRL, as quais serão detalhadas nos próximos tópicos desta aula.

Antes de iniciar seu trabalho, você deve consultar os protocolos de Procedimentos Operacionais Padrão (POP), que descrevem detalhadamente:

• os procedimentos a serem realizados para cada conjunto diagnóstico;

• as instruções de uso e os cuidados a serem adotados em cada equipamento que será utilizado;

• o passo a passo de ações para cada atividade.

AÇÃO 2 – Preparar os protocolos de trabalho

AÇÃO 8 – Realizar reação de VDRL quantitativa

AÇÃO 5 – Utilizar soros – controle

AÇÃO 3 – Preparar a suspensão antigênica

AÇÃO 9 – Anotar os resultados e liberar os resultados

AÇÃO 4 – Calibrar a agulha

AÇÃO 1 – Organizar os materiais necessários

AÇÃO 7 – Realizar reação de VDRL qualitativa

AÇÃO 6 – Validar a suspensão antigênica

9Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Ação 1 – Organização dos materiais necessários para o teste de VDRL Os materiais necessários para a realização do teste estão listados a seguir.

• Soros controles: reagente com título conhecido e não reagente.

• Seringa de vidro de 1 mL ou 2 mL.

• Agulha calibrada para gotejar 17 µL ou pipeta para volume de 17 µL.

• Erlenmeyer de 25 mL com tampa de vidro esmerilhado.

• Lâminas de vidro planas, demarcadas com 12 círculos com 14 m de diâmetro cada (lâminas de VDRL).

• Agitador orbital, tipo Kline, ajustado para 180± 2 rpm.

• Microscópio óptico comum (objetiva 10X e ocular 10X).

• Banho-maria a 56°C.

• Pipetas de volume ajustável entre 50 µL e 200 µL. • Ponteiras descartáveis para volumes entre 50 µL e 200 µL.

• Pipetas de vidro de 1 mL e 5 mL.

• Recipiente para descarte de ponteiras.

• Recipiente de vidro para descontaminação de produtos biológicos, contendo solução aquosa de hipoclorito de sódio (uma parte de água sanitária comercial mais quatro partes de água).

• Cronômetro.

• Caneta para escrever em vidro.

Verifique sempre o nível de água do banho-maria e se a temperatura está em 56ºC.

10Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Ação 2 – Preparar os protocolos de trabalho Observe o modelo de protocolo de trabalho indicado a seguir.

Algumas ações são importantes na hora de preparar os protocolos de trabalho. Confira a seguir.

• Antes de iniciar seu trabalho diário, reveja o conteúdo dos POP e compare se está de acordo com as bulas.

• Observe se houve alteração dos procedimentos recomendados pelo fabricante para testes de diferentes lotes.

• Observe se os procedimentos variam quando o conjunto diagnóstico é utilizado com amostras diferentes, como VDRL no soro ou no líquor.

• Leia sempre as bulas e mantenha-as disponíveis para consulta.

11Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

Ação 3 – Preparar a suspensão antigênica de VDRL

O preparo da suspensão antigênica a partir do antígeno concentrado deve seguir as instruções do fabricante. Existe padronização internacional para esse teste. Este padrão é o que foi adotado nesse curso. Caso o kit que você dispõe defina uma orientação diferente dessa, siga o que foi definido pelo fabricante do produto que você dispõe.

Instruções para preparo da suspensão antigênica

1Pipete 0,4 mL da salina tamponada pH 6,0 (que acompanha o kit) no fundo do Erlenmeyer. Use uma pipeta de vidro para volume até 1 mL.

2Retire 0,5 mL do frasco do antígeno com uma pipeta de vidro para volume até 1 mL. Tampe o frasco para evitar evaporação.

4Adicione 0,5 mL do antígeno, gota a gota, diretamente sobre a salina.

5Faça movimentos circulares, contínuos e suaves com o Erlenmeyer apoiado na bancada. Para obter a velocidade ideal de rotação, você deve, a cada segundo, dar três voltas com o Erlenmeyer, formando um círculo de aproximadamente 5 cm de diâmetro.

6Certifique-se de que, ao final de 6 segundos, todo o antígeno esteja gotejado (inclusive a última gota).

7Continue fazendo movimentos circulares por mais 10 segundos.

8Adicione ao Erlenmeyer 4,1 mL da salina tamponada com uma pipeta de vidro para volume até 5 mL.

9Tampe o Erlenmeyer e homogeneíze a suspensão fazendo movimentos suaves de inversão – aproximadamente 30 vezes.

10Identifique a suspensão antigênica escrevendo no Erlenmeyer: Suspensão para VDRL, a data e a hora do preparo.

O antígeno concentrado está dissolvido em álcool. Se o frasco ficar aberto, ocorrerá sua evaporação e haverá mudança na concentração do antígeno.

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A qualidade da reação de VDRL depende do preparo da suspensão antigênica. Por isso, prepare sempre o volume de 5,0 mL de suspensão antigênica – seguindo o procedimento descrito no quadro passo a passo anterior –, mesmo que a quantidade de amostras a ser analisada seja pequena.

Se houver um grande número de amostras na sua rotina laboratorial, prepare duas, três ou mais suspensões antigênicas com o volume total de 5 mL cada.

Não prepare volumes superiores a 5 mL em um mesmo Erlenmeyer.

Outro cuidado importante é o de nunca alterar os volumes da salina tamponada e do antígeno recomendados pelo fabricante.

Jamais utilize tampas de borracha no Erlenmeyer, pois ocorre a desestabilização das micelas.

Além disso, evite pipetas de plástico para a preparação da suspensão antigênica, porque o antígeno pode se aderir ao plástico.

Ação 4 – Calibrar a agulha

13Diagnóstico da Sífilis - Aula 2

É preciso calibrar a agulha que será usada na seringa para adicionar a suspensão antigênica na reação de VDRL. Para isso, comece cortando o bisel de uma agulha de calibre 18 G (gauge) de tal maneira que a estrutura metálica dessa agulha não fique amassada ou inadequada para uso. Depois, siga os procedimentos indicados no passo a passo a seguir.

Faça a calibração da agulha executando os passos descritos adiante.

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