Manual Aula 4 Reações de RPR em amostras

Manual Aula 4 Reações de RPR em amostras

1Diagnóstico da Sífilis - Aula 4

Aula 4Reações de RPR em amostras de soro

O RPR é um teste não treponêmico que permite a realização do teste sem inativação da amostra e leitura a olho nu. A partir de agora você conhecerá essa reação em detalhes.

A padronização desse teste determina que ele seja realizado em cartões descartáveis, de uso único, que contém círculos de 18 m de diâmetro. Infelizmente existem fabricantes que não incluem esses cartões em quantidade suficiente para a realização dos testes qualitativos e quantitativos. Por isso, alguns laboratórios os reutilizam.

Esse procedimento é inadequado e contraria as boas práticas laboratoriais. Materiais descartáveis devem ser descartados.

Assim, exija que o fornecedor do kit entregue os cartões em quantidade suficiente para fazer o número de testes que foram adquiridos pelo laboratório. Se houver recusa, denuncie o fornecedor à Vigilância Sanitária do seu estado.

Confira a seguir a sequência de sete ações recomendadas para você adotar em um teste RPR, as quais serão detalhadas nos próximos tópicos desta aula.

AÇÃO 2 – Preparar os protocolos de trabalho

AÇÃO 5 – Realizar reação de RPR qualitativa

AÇÃO 3 – Utilizar soros – controle

AÇÃO 4 – Testar a suspensão antigênica

AÇÃO 1 – Organizar os materiais necessários

AÇÃO 7 – Anotar os resultados e liberar os resultados

AÇÃO 6 – Realizar reação de RPR quantitativa

Reação de RPR com amostra de soro

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Antes de iniciar seu trabalho, você deve consultar os protocolos de Procedimentos Operacionais Padrão (POP), que descrevem detalhadamente:

• os procedimentos a serem realizados para cada conjunto diagnóstico;

• as instruções de uso e os cuidados a serem adotados em cada equipamento que será utilizado;

• o passo a passo de ações para cada atividade.

Ação 1 – Organização dos materiais necessários para o teste de RPR

Os materiais necessários para a realização do teste estão listados a seguir.

• Conjunto diagnóstico (kit) para RPR. • Solução salina (NaCl 0,9%).

• Soros controles: reagente com título conhecido e não reagente.

• Cartões para RPR, demarcados com 12 círculos com 18 m de diâmetro cada (cartões de RPR).

• Agitador orbital, tipo Kline, ajustado para 180± 2 rpm.

• Pipetas de volume ajustável entre 50 µL e 200 µL.

• Ponteiras descartáveis para volumes entre 50 µL e 200 µL.

• Recipiente para descarte de ponteiras.

• Recipiente de vidro para descontaminação de produtos biológicos, contendo solução aquosa de hipoclorito de sódio (uma parte de água sanitária comercial mais quatro partes de água).

• Cronômetro.

• Caneta para escrever em plástico.

Ação 2 – Preparar os protocolos de trabalho

3Diagnóstico da Sífilis - Aula 4 Observe o modelo de protocolo de trabalho indicado a seguir.

Algumas ações são importantes na hora de preparar os protocolos de trabalho. Confira a seguir.

• Antes de iniciar seu trabalho diário, reveja o conteúdo dos POP e compare se está de acordo com as bulas.

• Observe se houve alteração dos procedimentos recomendados pelo fabricante para testes de diferentes lotes.

• Observe se os procedimentos variam quando o conjunto diagnóstico é utilizado com amostras diferentes, como soro ou plasma.

• Leia sempre as bulas e mantenha-as disponíveis para consulta.

Ação 3 – Utilizar soros controles

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Os soros controles são amostras que foram previamente caracterizadas como não reagentes (soros controles negativo) ou reagentes (soros controles positivo). Seu uso na rotina diária permite ao profissional assegurar-se da qualidade do antígeno e dos testes que realiza.

Veja no próximo tópico como utilizar soros controles para testar a suspensão antigênica de RPR. Mais adiante, neste curso, você aprenderá mais sobre este tema ao estudar a respeito do controle de qualidade dos testes de floculação.

Mantenha os soros controles congelados a -20ºC em alíquotas com volume suficiente para que sejam utilizadas uma única vez.

Ação 4 – Validar a suspensão antigênica de RPR

Inicie o seu trabalho testando a qualidade da suspensão antigênica.

Para essa tarefa, você deverá dispor de soros controles positivos, com títulos previamente estabelecidos, e de soros controles negativos, selecionados das amostras da rotina de seu laboratório.

Jamais teste as amostras dos indivíduos sem ter validado a suspensão antigênica. Com esse procedimento, você irá se certificar de que não houve perda de reatividade na reação.

Acompanhe a seguir o passo a passo dessa tarefa, utilizando soros controles positivos com título 16 ou diluição 1/16 com a execução das diluições diretamente no cartão de RPR.

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Faça seu protocolo de trabalho marcando a posição dos controles e das amostras. 1Descongele os soros controles.

2Utilize a suspensão antigênica do kit RPR.

3Faça diluições seriadas do soro controle positivo – 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 – diretamente no cartão, conforme é apresentado a seguir.

a) Pipete 50 µL de solução salina nos círculos de números 3 a 7. b) Em seguida, pipete 50 µL de soro controle positivo no segundo círculo.

c) Pipete 50 µL de soro controle positivo no terceiro círculo, faça a homogeneização do soro com a solução salina três a quatro vezes, utilizando a mesma pipeta e ponteira. Para isso, aspire e devolva, cuidadosamente, a solução para o mesmo círculo da lâmina. Em seguida, transfira 50 µL dessa mistura para o quarto círculo.

d) Realize a homogeneização do conteúdo do quarto círculo e transfira 50 µL dessa mistura para o quinto círculo.

e) Proceda com a homogeneização e transfira a mistura sucessivamente até o sétimo círculo.

f) Por fim, homogeneíze a mistura no sétimo círculo, retire 50 µL e despreze-a em recipiente próprio para descarte de produto biológico.

4Pipete no primeiro círculo 50 µL do soro controle negativo.

6Dispense exatamente uma gota em cada um dos círculos de 1 a 7.

7Coloque o cartão no agitador orbital e deixe agitar por 8 minutos a 180 rpm.

8Faça a leitura da reação, imediatamente após o término da agitação.

9A suspensão antigênica estará validada para ser utilizada nas amostras da rotina se o controle negativo não apresentar floculação e se o controle positivo apresentar o título esperado – neste caso, de 1/16.

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Caso a suspensão antigênica não seja validada, utilize outro kit de RPR e repita o procedimento de validação da suspensão com os controles. Não utilize suspensões que não passaram no teste de validação.

Ação 5 – Realizar reação de RPR qualitativa

Antes de iniciar a reação, faça um protocolo para definir em que círculos da lâmina serão colocados os soros controles e as amostras em análise. Neste caso, os soros controles são usados para estabelecer o parâmetro para a leitura da floculação. Eles podem ser usados puros, uma vez que apresentam reatividade conhecida.

O teste qualitativo é realizado com as amostras de soro puro (1/1) e diluído a 1/8. Você deve fazer as diluições a 1/8 em tubos antes de iniciar o teste.

Confira o passo a passo a seguir.

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1Identifique um tubo para cada amostra.

2Pipete 350 µL de solução salina em cada tubo previamente identificado.

3Homogeneíze a amostra e pipete 50 µL no tubo correspondente. Com esses volumes você vai obter a diluição de 1/8.

4Pipete 50 µL do soro controle negativo no primeiro círculo do cartão de RPR.

5Pipete 50 µL do soro controle positivo no segundo círculo.

6Pipete 50 µL da amostra do usuário 1 pura (1/1) no terceiro círculo.

7Pipete 50 µL da amostra do usuário 1 diluída a 1/8 no quarto círculo.

8Repita o procedimento pipetando 50 µL de cada amostra pura e diluída das amostras em análise, tendo o cuidado de seguir a ordem que você estabeleceu no protocolo de trabalho.

10Aspire a suspensão antigênica até encher a seringa, retire o êmbolo e deixe pingar, no próprio Erlenmeyer, algumas gotas para eliminar bolhas de ar.

11Dispense exatamente uma gota em cada círculo da lâmina que contenha amostra.

12Coloque a lâmina no agitador orbital e deixe-a por 8 minutos sob agitação a 180 rpm.

13Faça a leitura da reação imediatamente após o término da agitação.

14Compare o resultado do controle negativo com o resultado das amostras testadas, para determinar o padrão de ausência de reatividade. Quando a reatividade da amostra estiver igual ao controle negativo, o resultado será não reagente. Caso seja observada reatividade na amostra pura ou diluída a 1/8, deverá ser feito o RPR qualitativo para determinar o título da amostra.

Quando a amostra de soro puro não apresentar reatividade, mas houver reatividade na amostra diluída a 1/8, terá ocorrido o fenômeno de prozona. Saiba mais sobre este fenômeno na Aula 2 do manual, página 2.

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Ação 6 – Realizar reação de RPR quantitativa

Veja agora o exemplo de um RPR quantitativo com diluições realizadas diretamente no cartão. Prepare antes seu protocolo de trabalho e defina os círculos nos quais serão pipetadas as amostras, as diluições que serão testadas e os soros controles.

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Confira os procedimentos no passo a passo a seguir.

1Realize diluições seriadas da amostra de 1/2 a 1/32. Você pode fazer a diluição em tubo e transferir 50 µL de cada diluição para o cartão, conforme previsto no protocolo, ou fazer a diluição diretamente na lâmina. Para isso:

a) pipete 50 µL de solução salina em cada um dos círculos de números 4 a 8; b) em seguida, pipete no terceiro círculo 50 µL da amostra 1; c) pipete 50 µL da amostra 1 no quarto círculo, faça a homogeneização do soro e da solução salina e transfira 50 µL dessa mistura para o quinto círculo; d) homogeneíze o conteúdo do quinto círculo e transfira 50 µL dessa mistura para o sexto círculo; e) proceda com a homogeneização e transfira, sucessivamente, até o oitavo círculo; f) homogeneíze a mistura no oitavo círculo, retire 50 µL e despreze em recipiente próprio para descarte de produto biológico.

2Pipete 50 µL do soro controle positivo no segundo círculo.

3Cuidadosamente, por inversão, homogeneíze a suspensão antigênica.

4Dispense exatamente uma gota em cada um dos círculos – do 1 ao 8.

5Coloque a lâmina no agitador orbital e deixe agitar por 8 minutos a 180 rpm.

6Faça a leitura da reação imediatamente após o término da agitação. a) Utilize o resultado do controle negativo para determinar o padrão de ausência de reatividade.

b) O título da amostra será definido pela última diluição que apresentar reatividade.

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Ação 7 – Registrar e liberar os resultados do teste RPR Ao finalizar a reação, você deverá transferir para o laudo os resultados anotados no protocolo.

As amostras reagentes devem ter o título reportado no laudo. !

O laudo deverá apresentar-se:

• legível, sem rasuras na sua transcrição; • escrito em língua portuguesa;

• datado e assinado por profissional habilitado.

O laudo deverá estar de acordo com o disposto na Resolução RDC nº 302/ANVISA, de 13 de outubro de 2005, suas alterações, ou outro instrumento legal que venha a substituí-la.

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Referências

LARSEN, S.A., POPE, V., JOHNSON, R.E., KENNEDY, JR., E.J. A Manual of Tests for Syphilis. Washington: APHA, 1998, 361p. 9ª edição

LARSEN S.A., STEINER, B.M., RUDOLPH, A.H. Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis. Clin. Microbiol. Rev., Washington, v.8, n.1, p.1-21, 1995.

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