microb bactérias meio cultura

microb bactérias meio cultura

(Parte 1 de 6)

Descrição dos Meios de

Cultura Empregados

Microbiológicos

nos Exames Módulo IV

1. Introdução1
Procedimentos gerais1
2. Meios de cultura para transporte e conservação2
Cary Blair2
Salina Tamponada2
Meio Stuart3
Ágar nutriente4
3. Meios para crescimento e isolamento6
Ágar Chocolate6
Ágar Thayer-Martin Chocolate7
Ágar Salmonella-Shigella (s)7
Caldo Selenito8
Caldo Tetrationato9
Caldo Tioglicolato com indicador10
Caldo Tioglicolato sem indicador1
Ágar Mac Conkey12
Ágar Sangue13
Ágar CLED – cystine lactose electrolyte deficient14
Caldo BHI – brain heart infusion15
Löwenstein Jensen16
Meio bifásico: Löwenstein e Middlebrook18
Ágar Mycosel19
Ágar Sabouraud20
4. Meios comerciais para provas de identificação2
Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base2
Ágar Citrato Simmons23
Ágar Bílis-Esculina24
Ágar Sangue - CAMP25
Caldo base de Moeller26
Ágar Dnase28
Ágar Esculina30
Ágar Fenilalanina31
CTA – Cystine Tryticase Agar32
Caldo Triptona e SIM3
Meio Caldo Triptona34
Caldo Malonato35
Caldo Nitrato36
Meio base para oxidação e fermentação - OF38
Ágar TSI – triplo açúcar ferro40
Ágar base uréia (christensen)41
5. Fórmulas e produtos para provas de identificação43
Para prova de catalase43
Para prova de coagulase43
Para prova de gelatinase45
Para prova de lecitinase46
Para prova de oxidase47
Para fermentação de carboidratos48
Para a prova de hidrólise49
Para crescimento a 42 e 44°c50
Para teste de motilidade51
Para prova de tolerância ao NaCl 6,5%5
6. Discos para identificação57
Bacitracina57
Novobiocina57
Optoquina58
7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos60
HTM – haemophilus test médium60
Ágar Mueller Hinton61
Ágar Mueller Hinton Sangue62

ÍNDICE 8. Referências bibliográficas ...............................................................................................64

Mod IV - 1

1. INTRODUÇÃO

Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.

Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga ou papel alumínio e adicionados em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.

Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen.

Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes;

Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC.

Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,2 micra, recomendado para partículas bacterianas.

Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;

Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.

Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.

Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilizade.

Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.

Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC , que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.

Se não for possível o uso de cepas ATCC , usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.

Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle de crescimento de que realmente está funcionando.

Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.

Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns meios de cultura.

Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 1 por 100 m).

As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 m de diâmetro.

Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento.

Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para evitar o ressecamento.

Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plásticos, procurando tirar o excesso de ar.

Mod IV - 2

2. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO

patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio

meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos

A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.

O que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindo da fórmula o azul de metileno.

UTILIDADE Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos.

FÓRMULA/ PRODUTO Meios comercial: Meio de transporte Cary Blair.

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Fundir completamente;

Distribuir 7 ml por tubo;

Esterilizar em autoclave;

Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para solidificar.

CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri ATCC 12022.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.

Introduzir um "swab" estéril de madeira nas fezes recém coletadas; Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; Fechar o tubo;

Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.

Cor original do meio: Branco opalescente. Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.

Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura. Não semear fezes coletadas com mais de 6 horas.

Mod IV - 3

PRINCÍPIO Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável.

UTILIDADE Meio de transporte de fezes.

NaCl4,2 g

Fórmula: Fosfato dipotássico anidro 3,1 g Glicerina bidestilada 300 ml Água destilada 700 ml

Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 m; Esterilizar em autoclave.

CONTROLE DE QUALIDADE Shigella flexneri ATCC 12022

Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.

O crescimento é indicado pela turbidez do meio. Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de S e/ou MacConkey.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses.

A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.

Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos. Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

FÓRMULA / PRODUTO Meios comercial: Meio de transporte STUART

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Fundir completamente;

Distribuir 7 ml por tubo;

Mod IV - 4

Esterilizar em autoclave; Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para que solidifiquem.

Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento):

Haemophilus influenzae ATCC 10211 Shigella flexneri ATCC 12022 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bordetella pertussis ATCC 9340

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por 1 a 2 semanas.

O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab" estéril com haste de madeira; Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; Fechar o tubo;

Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.

Cor original do meio: Branco opalescente. Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.

RECOMENDAÇÕES Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura.

O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia.

nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras.

uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC). Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.

Peptona5 g

Extrato de carne 3 g Ágar ágar 15 g Água destilada 1000 ml pH: 6,8 +/- 0,2

Mod IV - 5

Pesar e hidratar os componentes; Fundir;

Distribuir 3 ml por tubo;

Esterilizar em autoclave;

Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).

Crescimento bom a excelente:

Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.

Estriar a superfície inclinada do meio; Incubar.

Cor original do meio: branco opalescente Positivo: Crescimento na superfície do ágar;

Negativo: Ausência de crescimento.

Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do ágar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses.

Conservar as cepas após o crescimento no meio em temperatura ambiente.

Por ser um meio nutritivo, a ausência de crescimento não deverá ocorrer.

Mod IV - 6

3. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO

Meio de Ágar Chocolate é amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresçam neste meio quase todos os tipos de microrganismos.

À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes.

Observação: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC.

Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

Meios comerciais: BHI Ágar *, Columbia Ágar Base, Blood Ágar Base, Mueller Hinton Ágar. Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado.

Recomenda-se o uso da base de BHI Ágar, por apresentar melhor crescimento das cepas exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave;

Esfriar a base à temperatura de aproximadamente 80ºC;

Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 ml de base;

Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escuro (chocolate); Distribuir em placas de Petri de 90 m de diâmetro.

CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.

Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento; Incubar a 35ºC por 24 horas.

Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp,

Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.

RECOMENDAÇÕES Lembrar que é um meio rico e crescem vários tipos de microrganismos.

Mod IV - 7

Fazer esfregaço de todas as colônias suspeitas e corar pela técnica de Gram, para confirmar se trata-se ou não de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomérficos).

Não usar sangue de cavalo vencido.

Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.

É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis , pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados.

Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigação.

Meio comercial: Thayer-Martin Ágar Base. Sangue desfibrinado de carneiro.

Suplemento I: mistura de inibidores (antibióticos).

Suplemento I: mistura de fatores de crescimento.

Dissolver os suplementos liofilizados conforme instruções do fabricante (normalmente em água destilada estéril que já acompanha o kit) e reservar;

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante (normalmente prepara-se 200 ml de base para cada frasco de suplementos I e I ); Esterilizar em autoclave;

Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base;

Homogeneizar bem até lisar totalmente as hemácias e o meio apresentar uma cor castanho escura (chocolate); Deixar resfriar a base a 50ºC;

Adicionar assepticamente à base resfriada os suplementos previamente dissolvidos;

Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas;

Distribuir em placas de Petri de 90 m ou 4 ml por tubos e inclinar para a superfície ficar em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).

Ágar S possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos.

A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes.

Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.

Mod IV - 8

UTILIDADE Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar S.

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer o meio até fundir o ágar;

Resfriar até 50°C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 m estéreis;

Deixar em temperatura ambiente até resfriar;

Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.

Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.

Cor original do meio: vermelho alaranjado.

Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella. Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.

Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp.

As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.

As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por 3 meses.

Ausência de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. Não autoclavar, pois a alta temperatura degrada o açúcar contido no meio.

PRINCÍPIO Tem propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.

Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.

Meio comercial: Selenito Novobiocina

Mod IV - 9

Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer até levantar fervura, homogeneizando de vez em quando;

Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o véu de

Proteus spp.); Distribuir 7 ml em tubos estéreis de 15x150 m com tampa de rosca.

Crescimento: Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland; Semear 0,01 ml da suspensão na placa de S;

Incubar a placa a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.

Negativo: não á crescimento de Escherichia coli

Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium.

Inocular 3 a 4 alçadas da amostra de fezes no meio de cultura; Incubar a 35±1°C por 12 a 18 horas.

Cor original do meio: vermelho tijolo. Após incubação, semear com o auxílio de uma alça bacteriológica em meios seletivos e enriquecidos (S, Mac Conkey, XLD, Hectoen).

(Parte 1 de 6)

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